張軒

(武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院 食品與生物科技學(xué)院，湖北 武漢 430205)

大蒜是我國一大優(yōu)勢資源，年產(chǎn)量占世界總量的1/4，出口量居世界第4位[1]。大蒜油又稱大蒜素，是大蒜破碎以后，由蒜氨酸在蒜氨酸酶作用下形成的一種油狀有機(jī)硫化物，具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤、降脂降糖、保護(hù)心腦血管健康、提高機(jī)體免疫力等作用[2-3]。大蒜油的開發(fā)不僅具有很好的商業(yè)價(jià)值，還可提高大蒜這一農(nóng)產(chǎn)品的附加值，對農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化、農(nóng)民增收起到積極的促進(jìn)作用[4]。相比目前文獻(xiàn)所報(bào)道的單純的超聲波輔助有機(jī)溶劑提取大蒜油[5-7]，本課題將蒜氨酸酶活性調(diào)控理論應(yīng)用到提取工藝中，以期提高大蒜油的提取率，為工業(yè)上大蒜油的獲取提供有一定價(jià)值和意義的參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

白皮大蒜；無水乙醇、氯化錳、氯化鎂、磷酸吡哆醛(PLP)、甘油、氯化鋇、硝酸、甲基橙等均為分析純。

722 型可見分光光度計(jì)；HH-S6型恒溫水浴鍋；FA2014B型電子分析天平；DFY-300型組織搗碎機(jī)；MEC-200SAH型超聲波合成萃取儀；RE52-CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

大蒜去皮后用組織搗碎機(jī)搗碎。取30 g蒜泥(精確到0.01 g)放入250 mL三角瓶中，加入15 mmol/L氯化錳溶液、2 mmol/L PLP溶液、10 mmol/L甘油、10 mmol/L氯化鎂溶液各5 mL，在35 ℃，pH 6.5條件下酶解60 min。放入超聲波合成萃取儀中，添加95%乙醇，液料比為5∶1 mL/g，超聲功率600 W，在35 ℃下超聲萃取50 min。

根據(jù)GB 8862—1988《脫水大蒜揮發(fā)性有機(jī)硫化合物的測定方法》，以濃硝酸滴定大蒜油樣品，將其中的硫醚基團(tuán)氧化成硫酸根離子，再采用硫酸鋇沉淀稱重法換算出大蒜油中有機(jī)硫化物的含量[8]。

2 結(jié)果與討論

2.1 蒜氨酸酶促反應(yīng)條件對大蒜油提取率的影響

2.1.1 酶促反應(yīng)溫度對大蒜油提取率的影響 取新鮮蒜泥6份，每份30 g，酶解溫度分別為25，30，35，40，45，50 ℃，其他提取條件保持不變，結(jié)果見圖1。

圖1 酶促反應(yīng)溫度對大蒜油提取率的影響Fig.1 Effect of enzymatic reaction temperature on extraction rate of garlic oil

由圖1可知，隨著溫度的提高，蒜氨酸酶的催化效率提高，溫度35 ℃時(shí)，大蒜油的提取率最高，為0.397%，溫度繼續(xù)升高，酶蛋白逐漸變性失活，相應(yīng)大蒜油的提取率開始降低。因此，選擇最適酶解溫度為35 ℃。

2.1.2 酶促反應(yīng)pH對大蒜油提取率的影響 取新鮮蒜泥5份，每份30 g，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)蒜泥pH分別為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，其他提取條件保持不變，結(jié)果見圖2。

圖2 酶促反應(yīng)pH對大蒜油提取率的影響Fig.2 Effect of enzymatic reaction pH on extraction rate of garlic oil

pH直接影響著蒜氨酸酶活性中心基團(tuán)的解離，對蒜氨酸酶活性影響顯著。由圖2可知，隨著pH的升高，大蒜油的提取率先升高后降低，在pH為6.5 時(shí)，大蒜油的提取率最高，為0.385%，這一趨勢同蒜氨酸酶的酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果一致[9]。選擇最適酶解pH為6.5。

2.1.3 酶促反應(yīng)時(shí)間對大蒜油提取率的影響 取新鮮蒜泥6份，每份30 g，控制酶解時(shí)間，其他提取條件保持不變，結(jié)果見圖3。

圖3 酶促反應(yīng)時(shí)間對大蒜油提取率的影響Fig.3 Effect of enzymatic reaction time on extraction rate of garlic oil

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長，大蒜油的提取率逐漸上升，但當(dāng)酶解時(shí)間>60 min后，大蒜油的提取率上升趨于平緩，100 min后提取率開始下降。推測可能隨著酶解時(shí)間的延長，大蒜油中有機(jī)硫化物被催化為其他副生產(chǎn)物。綜上，選擇最適酶解時(shí)間60 min。

2.1.4 外加酶激活劑對大蒜油提取率的影響 PLP是蒜氨酸酶重要的輔酶因子，外源添加PLP可提高蒜氨酸酶活，其通過與酶蛋白的亞基結(jié)合，催化裂解底物蒜氨酸，Mn2+則通過靜電作用促使底物結(jié)合在酶活性中心靠近PLP的部位，從而促進(jìn)酶反應(yīng)的進(jìn)行，是蒜氨酸酶良好的激活劑[10]。甘油作為反應(yīng)體系中引入的多羥基化合物，在Mg2+的配合使用下，可保護(hù)蒜氨酸酶活性，同時(shí)因其親水性，減弱了酶蛋白與水分子之間的相互作用，從而促進(jìn)酶蛋白疏水活性中心的形成，使底物與酶的活性中心更好地結(jié)合，有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行。

在酶解溫度35 ℃、酶解pH 6.5、酶解時(shí)間60 min下，向蒜泥添加MnCl2、PLP、MgCl2、甘油溶液各5 mL，設(shè)置正交實(shí)驗(yàn)，確定其最適添加量。超聲提取條件不變，結(jié)果見表1。

由表1可知，外加酶激活劑對大蒜油提取率的影響程度依次為PLP>Mn2+>Mg2+>甘油，大蒜油提取得率最高的最優(yōu)組合為A2B3C2D2，即在最適酶反應(yīng)條件下，加入2 mmol/L PLP溶液、15 mmol/L氯化錳溶液、10 mmol/L甘油、10 mmol/L氯化鎂溶液各5 mL，而后進(jìn)行超聲波提取。在此最優(yōu)條件下進(jìn)行三組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，大蒜油的提取率分別為0.445%，0.433%，0.468%，平均提取率為0.449%。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal experimental results

2.2 超聲提取條件對大蒜油提取率的影響

2.2.1 提取溫度的影響 取新鮮蒜泥6份，每份30 g，采用最佳酶解條件酶解后，分別在25，30，35，40，45，50 ℃下進(jìn)行超聲提取，其他條件保持不變，結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度對大蒜油提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on garlic oil extraction rate

由圖4可知，在35 ℃下大蒜油的提取率最高，可達(dá)0.451%，溫度繼續(xù)升高，大蒜油發(fā)生降解，提取率隨之下降。選擇超聲提取的最佳溫度為35 ℃。

2.2.2 提取時(shí)間的影響 取新鮮蒜泥6份，每份30 g，采用最佳酶解條件酶解后，分別進(jìn)行超聲提取，其他條件保持不變，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，隨著提取時(shí)間的延長，大蒜油充分轉(zhuǎn)移至有機(jī)相，提取率也隨之提高，提取時(shí)間為50 min時(shí)，提取率最高，可達(dá)0.443%；繼續(xù)延長提取時(shí)間會造成大蒜油一定程度的分解，提取率逐漸降低。選擇最佳超聲提取時(shí)間為50 min。

圖5 提取時(shí)間對大蒜油提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on garlic oil extraction rate

2.2.3 乙醇濃度的影響 取新鮮蒜泥4份，每份30 g，采用最佳酶解條件酶解后，分別采用65%，75%，85%，95%乙醇進(jìn)行超聲提取，其他條件保持不變，結(jié)果見圖6。

圖6 乙醇濃度對大蒜油提取率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on garlic oil extraction rate

由圖6可知，隨著乙醇濃度的升高，大蒜油的提取率逐漸提高，說明大蒜油易溶于有機(jī)溶劑，乙醇濃度95%時(shí)，大蒜油的提取率最高，為0.451%。

2.2.4 液料比的影響 取新鮮蒜泥5份，每份30 g，采用最佳酶解條件酶解后，控制液料比分別為2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1進(jìn)行超聲提取，其他條件保持不變，結(jié)果見圖7。

圖7 液料比對大蒜油提取率的影響Fig.7 Effect of liquid to material ratio on extraction rate of garlic oil

由圖7可知，隨著液料比的提高，大蒜油提取率逐漸提高，液料比≥4∶1 mL/g后，提取率增長趨于平緩，提示大蒜油已被充分提取。選擇最佳液料比為4∶1 mL/g。

2.2.5 超聲功率的影響 取新鮮蒜泥4份，每份30 g，采用最佳酶解條件酶解后，控制超聲功率分別為200，300，400，500，600 W進(jìn)行超聲提取，其他條件保持不變，結(jié)果見圖8。

圖8 超聲功率對大蒜油提取率的影響Fig.8 Effect of ultrasonic power on garlic oil extraction rate

由圖8可知，隨著超聲功率的提高，大蒜油提取率逐漸升高，超聲功率500 W時(shí)，大蒜油提取率為0.443%；功率繼續(xù)升高，大蒜油提取率無顯著升高。選擇提取功率為500 W。

2.2.6 超聲提取條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以濃度95%的乙醇作為提取劑，對提取溫度、提取時(shí)間、液料比、超聲功率進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results

由表2可知，超聲提取條件對大蒜油提取率的影響程度依次為：溫度>液料比>功率>時(shí)間，大蒜油提取得率最高的最優(yōu)組合為A2B2C3D3，即酶解后，添加濃度95%的乙醇，并控制液料比為5∶1 mL/g，超聲功率600 W，35 ℃下超聲萃取50 min。在此最優(yōu)條件下進(jìn)行三組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，大蒜油的提取率分別為0.469%，0.473%，0.463%，平均提取率為0.468%。

2.3 對照實(shí)驗(yàn)

大蒜去皮用組織搗碎機(jī)搗碎后，取新鮮蒜泥3份，每份30 g，不經(jīng)充分酶解，立即采用上述最佳超聲提取條件提取大蒜油，大蒜油的提取率分別為0.296%，0.312%，0.288%，平均提取率為 0.299%。這說明，與傳統(tǒng)的超聲輔助提取大蒜油工藝相比，控制外部條件，將大蒜充分酶解后再進(jìn)行超聲提取，可顯著提高大蒜油的提取率。

3 結(jié)論

超聲波輔助乙醇提取大蒜中大蒜油的最佳工藝條件為：以30 g蒜泥計(jì)，加入2 mmol/L PLP溶液、15 mmol/L氯化錳溶液、10 mmol/L甘油、10 mmol/L氯化鎂溶液各5 mL，在35 ℃，pH 6.5條件下酶解60 min，然后放入超聲波合成萃取儀中，添加濃度95%的乙醇，并控制液料比5∶1 mL/g，超聲功率600 W，在35 ℃下超聲萃取50 min。在此條件下，大蒜油平均提取率可達(dá)0.468%。