智發(fā)朝，王曄，劉洋洋，李平,梁德寶

隨著微生物組學(xué)的研究深入，越來越多的研究證據(jù)顯示微生物與人體的健康密切相關(guān)[1-2]，特定的活菌對(duì)于多種疾病有較好的治療效果[3-4]。人體有70%以上的黏膜免疫發(fā)生在腸道，通過復(fù)雜的免疫機(jī)制，腸道和腸道菌群與全身器官產(chǎn)生緊密聯(lián)系，腸道菌群作為一個(gè)核心要素已逐漸得到深入認(rèn)識(shí)。

益生菌的開發(fā)歷程可分為兩個(gè)階段，第一階段為益生菌作為膳食補(bǔ)充劑或輔助治療(常見食品可使用菌種/菌株)，期間逐漸認(rèn)識(shí)到益生菌對(duì)于腸道腹瀉、便秘等有一定作用，這一階段經(jīng)歷了數(shù)十年。近年來，隨著測(cè)序與分離技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了更多的與疾病密切相關(guān)、但尚無人體應(yīng)用歷史的新菌種，進(jìn)入到第二階段，即Next-generation probiotics(二代益生菌或新一代益生菌)階段，核心為利用新菌種或工程菌、按藥物(Live Biotherapeutic Products，活體生物藥)進(jìn)行開發(fā)[5]。

利用微生物作為生物標(biāo)志物以評(píng)估疾病進(jìn)展、干預(yù)疾病是目前基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究的熱門方向。國(guó)際上涌現(xiàn)了一批科研機(jī)構(gòu)及企業(yè)正致力于將活菌作為治療手段開發(fā)利用，特別是開發(fā)成活菌藥物。

1 活菌藥物開發(fā)的指導(dǎo)原則

關(guān)于益生菌類產(chǎn)品的開發(fā)，2000年以來有一系列的指南，包括2002年WHO和FAO《益生菌食品評(píng)價(jià)指南》[6]、2006年歐盟PROSAFE項(xiàng)目(Biosafety Evaluation of Probiotic Lactic Acid Bacteria for Human Consumption)對(duì)益生菌安全性評(píng)價(jià)的建議[7]、2013年挪威食品安全科學(xué)委員會(huì)(VKM)《醫(yī)院病人用益生菌的評(píng)價(jià)指南》[8]、2014年VKM《益生菌食品安全性評(píng)價(jià)的指導(dǎo)原則》[9]等。

上述指南仍以食品或膳食補(bǔ)充劑為主。第一個(gè)明確按藥物出現(xiàn)的指南，是2016年美國(guó)FDA/CBER發(fā)布的“EarlyClinicalTrialswithLiveBiotherapeuticProducts:Chemistry,Manufacturing,andControlInformation，活體生物藥的早期臨床：CMC信息”(以下簡(jiǎn)稱“FDA指南”)。該指南側(cè)重的是LBP早期臨床階段的CMC相關(guān)技術(shù)要求。

指南將LBP定義為一種生物活性藥物，具有如下特征：①含有活的生物體，如細(xì)菌；②用于預(yù)防、處理、治療人類疾病或適應(yīng)癥；③非疫苗。核心要點(diǎn)為，按新藥開發(fā)，明確適應(yīng)癥，進(jìn)行系統(tǒng)的菌株、藥效、安全性、CMC和臨床評(píng)價(jià)。除了生物制品的一些共性特點(diǎn)外，F(xiàn)DA指南提示了活菌藥物特有的研究重點(diǎn)，如鑒定到株水平，穩(wěn)定性，菌株的抗生素敏感性、耐藥及是否轉(zhuǎn)移，是否存在移位可能，產(chǎn)品的生產(chǎn)控制與穩(wěn)定性等。

中國(guó)藥典(2015版)中也有相關(guān)指南(微生態(tài)活菌制品總論)，對(duì)庫(kù)檢定、產(chǎn)品制備、檢定等進(jìn)行了要求[10]。

2 國(guó)際活菌藥物在研現(xiàn)狀

FDA指南明確指出(也是藥物開發(fā)所必須)，LBP要有明確的適應(yīng)癥，同時(shí)在特定適應(yīng)癥上的臨床效果也必須經(jīng)過嚴(yán)格的臨床試驗(yàn)來證實(shí)。

實(shí)際上，目前國(guó)際上按藥物批準(zhǔn)的活菌藥物極少，如Mutaflor，其適應(yīng)癥為潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)緩解期的維持治療，支持的臨床證據(jù)包括3項(xiàng)在UC患者中進(jìn)行的隨機(jī)雙盲對(duì)照試驗(yàn)，采用的陽(yáng)性藥物均為UC緩解期維持治療的一線藥物——美沙拉嗪[11-13]。

此外，目前國(guó)際上在研的活菌藥物品種有數(shù)十個(gè)，均處于臨床試驗(yàn)和臨床前階段(表1、2)。進(jìn)入臨床研究階段的品種有20個(gè)左右，集中在消化疾病、泌尿、皮膚。消化領(lǐng)域，多針對(duì)炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)、艱難梭菌感染(Clostridium difficile infection，CDI)、腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)、壞死性小腸結(jié)腸炎等適應(yīng)癥，有糞便菌、微生物組合物、復(fù)合菌、單菌和工程菌。國(guó)內(nèi)僅彎曲乳桿菌(Lactobacilluscrispatus, CTV-05，用于細(xì)菌性陰道炎，同類菌株LACTIN-V已在國(guó)外進(jìn)入臨床)一個(gè)品種進(jìn)入臨床。

臨床前研究階段的活菌藥物應(yīng)用領(lǐng)域除了前述的消化、泌尿和皮膚外，還連續(xù)出現(xiàn)了自身免疫疾病、腫瘤、感染類，這也從另外一個(gè)方面反映了活菌藥物的應(yīng)用廣泛，有較大的開發(fā)價(jià)值。

國(guó)內(nèi)活菌藥物研發(fā)的進(jìn)度遠(yuǎn)落后于國(guó)際。CDE檢索發(fā)現(xiàn)，新申請(qǐng)臨床的僅有彎曲乳桿菌(Lactobacilluscrispatus, CTV-05，用于細(xì)菌性陰道炎)和SK08活菌散(Bacteroidesfragilis，ZY-312，用于IBS和IBD，無同類菌株申請(qǐng)臨床先例)兩項(xiàng)。

早期發(fā)現(xiàn)階段，探討的方向更多，例如治療代謝性疾病、腫瘤治療的聯(lián)合用藥、工程菌導(dǎo)入抗體治療腫瘤等。

表2 國(guó)際臨床前階段的活菌藥物(截止2019-01-30，信息來源：湯森路透)

值得指出的是，國(guó)內(nèi)目前有20余個(gè)微生態(tài)活菌制品(此類品種在美國(guó)或歐盟均未被作為藥物批準(zhǔn))，基本上都是90年代末00年代初開發(fā)。10多年后回顧，在藥物評(píng)價(jià)的多個(gè)環(huán)節(jié)上有進(jìn)一步提高和完善的可能。如在適應(yīng)癥方面，上述微生態(tài)活菌制品基本上都是籠統(tǒng)的“各種原因引起的急慢性腹瀉”，而不是嚴(yán)格的適應(yīng)癥。相應(yīng)地，規(guī)范的臨床試驗(yàn)證據(jù)也不足。

3 活菌藥物在開發(fā)與評(píng)價(jià)過程中一些值得考慮的關(guān)鍵問題

3.1 臨床定位與療效指標(biāo)

對(duì)于特定適應(yīng)癥，與現(xiàn)有治療手段(化藥、生物藥)相較，如何定位？一線、二線還是三線？頭對(duì)頭能直觀比較療效，但方案設(shè)計(jì)(對(duì)臨床效果的預(yù)期)與倫理值得考慮。聯(lián)合用藥一個(gè)顯見問題是市場(chǎng)價(jià)值。主要療效指標(biāo)為現(xiàn)有臨床金標(biāo)準(zhǔn)，微生物或菌群指標(biāo)可能只是次要指標(biāo)或者科研觀察。考慮到腸道微生態(tài)與活菌藥物的特性，基于微生物組的精準(zhǔn)診斷和治療是否可行？

3.2 臨床藥理藥代研究

化學(xué)藥物有經(jīng)典的DMPK研究。蛋白、抗體等生物大分子藥物，也有相應(yīng)的藥代動(dòng)力學(xué)研究?；诨罹幬锏奶匦?，難以進(jìn)行相同的研究，但可考察活菌在體內(nèi)的分布定植，作為輔助判斷。VP20621的人體臨

床研究中，收集糞便或直腸拭子，然后用特異性的培養(yǎng)基分離培養(yǎng)目標(biāo)菌，并使用REA法進(jìn)行分子分型[14]，但該類方法適用于非腸道原籍菌的品種。對(duì)于屬于人體原籍菌屬的品種，可采用一些生物/化學(xué)標(biāo)記方法，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可進(jìn)行，在人體評(píng)價(jià)上則受限。

3.3 臨床安全性評(píng)價(jià)特點(diǎn)

臨床前的安全性評(píng)價(jià)(包括菌株安全性評(píng)價(jià)和GLP安全性評(píng)價(jià))，有著具體要求，此處不再深入討論。較之化藥和一般生物制品，活菌藥物的臨床安全性更好，不良反應(yīng)少，但仍存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。活菌藥物在理論上可能會(huì)帶來4類不良反應(yīng)，包括胃腸道相關(guān)不良反應(yīng)、感染、有害的代謝作用、易感個(gè)體的過度免疫刺激以及基因轉(zhuǎn)移[15]，后兩者目前在臨床上并無發(fā)生的相關(guān)證據(jù)[15]，其余3類不良反應(yīng)的主要表現(xiàn)見表3。在臨床試驗(yàn)中，應(yīng)充分考慮到活菌藥物可能引起的不良反應(yīng)(表4)，并制定好應(yīng)急方案，做好藥物預(yù)警。

表3 益生菌相關(guān)不良反應(yīng)

表4 活菌藥物臨床研究中的不良反應(yīng)

3.4 藥學(xué)研究特點(diǎn)

活菌藥物有著特有的藥學(xué)特性，直接影響到藥物的關(guān)鍵評(píng)價(jià)，其中比較突出的是穩(wěn)定性?；罹幬锒嗖环€(wěn)定，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中活菌數(shù)多為規(guī)定下限(現(xiàn)也有某些品種規(guī)定了上下限)，加之活菌分析方法(活菌計(jì)數(shù))的偏差較大，所以在進(jìn)行劑量耐受性研究和臨床量效關(guān)系時(shí)，特別要注意這點(diǎn)。

4 展望

按照藥物開發(fā)的活菌藥物，開發(fā)者對(duì)于其適應(yīng)癥和臨床定位必須有清晰的認(rèn)識(shí)。一方面是基于臨床前研究和臨床應(yīng)用效果的判斷；另一方面是臨床方案的科學(xué)設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)，譬如對(duì)已有標(biāo)準(zhǔn)藥物治療手段的適應(yīng)癥、對(duì)于腫瘤和代謝性疾病等。

不同于目前機(jī)制清晰的藥物(如激酶抑制劑和抗體類藥物)，活菌藥物候選物的臨床前篩選和評(píng)價(jià)也是難點(diǎn)之一。目前人體微生物組學(xué)快速發(fā)展，對(duì)于微生物與疾病致病關(guān)系，包括微生物培養(yǎng)組與致病棲生菌譜(Pathobionts)研究、靶標(biāo)確定以及新功能菌株分離將是研究重點(diǎn)。

From bench to bedside的產(chǎn)業(yè)化瓶頸。目前在國(guó)內(nèi)，菌株分離和初步研究多在科研院所和醫(yī)院開展，進(jìn)而的成藥性評(píng)價(jià)和臨床前研究極其困難，導(dǎo)致一些產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵點(diǎn)難以預(yù)先進(jìn)行評(píng)估，比如厭氧菌的產(chǎn)品化。但隨著近年來國(guó)內(nèi)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，這條研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈也在逐漸形成中。

從FDA和EMA批準(zhǔn)臨床的品種來看，有單菌與復(fù)合菌外的成分復(fù)雜的混合菌品種，也有炎癥性腸病之外的多種適應(yīng)癥，接受度較寬。國(guó)內(nèi)由于活菌藥物品種申報(bào)極少，對(duì)于活菌藥物評(píng)價(jià)的一些關(guān)鍵點(diǎn)(如缺少人體服用歷史的新菌株的安全性評(píng)價(jià)、CMC開發(fā)的階段性要求)仍處于探索中，應(yīng)盡快形成共識(shí)，推動(dòng)我國(guó)活菌藥物的發(fā)展。