張海梅,郭虎林,申大年,劉琪,馬苑寧
原發(fā)性肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)占肝癌的70%~90%,發(fā)病率高,死亡率高,是全球男性癌癥死亡的第二大原因[1-2]。乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)長(zhǎng)期感染是導(dǎo)致HCC產(chǎn)生、發(fā)展及治療后復(fù)發(fā)的重要危險(xiǎn)因素[3-4]。
Th17細(xì)胞亞群最早在自身免疫性疾病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)P椭斜话l(fā)現(xiàn),因其合成并分泌IL-17而被命名為“Th17細(xì)胞”[5]。IL-17可以有效介導(dǎo)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致組織器官自身免疫損害,在感染性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤的病理過(guò)程中發(fā)揮作用。
IL-22是新近發(fā)現(xiàn)的一類輔助型CD4+T 細(xì)胞,首先在胸腺淋巴瘤、T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞中由IL-9誘導(dǎo)產(chǎn)生[6]。在人類中,IL-22主要由Th1和Th22T細(xì)胞亞群產(chǎn)生,IL-22受體復(fù)合物由IL-22R/IL-10R2組成,其表達(dá)于各種器官的上皮細(xì)胞上[7]。主要分泌IL-22而不是IFN-γ/IL-17 13的輔助性T細(xì)胞的一個(gè)集合被命名為T(mén)h22細(xì)胞,在Th22細(xì)胞中起著重要的作用。眾所周知,不同的T細(xì)胞亞群(Treg 12、Th17細(xì)胞)及其相關(guān)細(xì)胞因子在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。
本研究中,我們收集乙肝相關(guān)性肝癌患者(觀察組)30例及體檢健康者(對(duì)照組)30例,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)兩組血清IL-17、IL-22的含量,比較兩組血清IL-17、IL-22的水平,并檢測(cè)患者肝功能,分析IL-17、IL-22水平與肝功能血清生化指標(biāo)的相關(guān)性。采用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,F(xiàn)C)檢測(cè)兩組外周血Th17和Th22細(xì)胞的外周頻率,分析Th17、Th22細(xì)胞水平與肝功能血清生化指標(biāo)的相關(guān)性,為該疾病的發(fā)病機(jī)制以及藥物的靶向治療提供依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。
觀察組患者均為我院2016年1月到2018年1月住院的乙肝相關(guān)性肝癌患者,診斷標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)《CSCO肝癌診療指南》[8]。對(duì)照組均來(lái)自我院體檢中心健康體檢志愿者,既往均無(wú)肝病史,體檢各項(xiàng)功能均正常。本項(xiàng)臨床研究由青海省第五人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有受試者均了解試驗(yàn)項(xiàng)目并簽署了知情同意書(shū)。觀察組30例,男20例,女10例,平均年齡(50.76±6.50)歲;對(duì)照組30例,男25例,女5例,平均年齡(51.54±5.26)歲。兩組性別、年齡等一般資料比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,表1),具有可比性。
兩組研究對(duì)象均于清晨采集空腹靜脈血,離心后取上層血清,-20 ℃保存。
1.3.1 ELISA 法
人IL-17和人IL-22酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)買(mǎi)于南京建成公司。取血清按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,包括標(biāo)準(zhǔn)液配平、加樣、洗滌、顯色、終止,最后酶標(biāo)儀分析軟件測(cè)得OD值,得出標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣本濃度。
1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)
eFluor-660聯(lián)合人源抗IL-22購(gòu)買(mǎi)于e生物科技公司,F(xiàn)ITC聯(lián)合IFN-γ和抗IL-17-PE購(gòu)買(mǎi)于BD生物公司。按照說(shuō)明書(shū)配置樣本后,分別加入IL-17-PE和IL-22- PE,離心后加PBS上機(jī),使用FlowJo software version 7.6.1進(jìn)行分析。
采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乙肝相關(guān)性肝癌患者和健康志愿者外周血中Th-17和Th-22細(xì)胞頻數(shù),結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1a和圖1b可知,觀察組中外周血Th-17細(xì)胞頻數(shù)高于對(duì)照組,圖1c的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);同時(shí),由圖1d和圖1e可知,觀察組中外周血Th-22細(xì)胞頻數(shù)高于對(duì)照組,圖1f的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
圖a和b是乙肝相關(guān)性肝癌患者與健康人外周血Th-17細(xì)胞頻數(shù)的流式細(xì)胞圖,圖d和e是Th-22細(xì)胞頻數(shù)的流式細(xì)胞圖;圖c和f是Th-17、Th-22細(xì)胞頻數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析。觀察組中外周血Th-17細(xì)胞頻數(shù)高于對(duì)照組,t=2.561,P=0.013;同時(shí),觀察組中外周血Th-22細(xì)胞頻數(shù)高于對(duì)照組t=4.089,P=0.000
圖1兩組外周血細(xì)胞頻數(shù)的比較
采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)乙肝相關(guān)性肝癌患者和志愿者外周血清中IL-17、IL-22濃度,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,乙肝相關(guān)性肝癌患者組血清中IL-17、IL-22的含量顯著高于健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
圖a顯示觀察組中血清IL-17水平高于對(duì)照組,t=2.486,P=0.016;圖b顯示觀察組血清IL-22水平高于對(duì)照組,t=4.345,P=0.000圖2 兩組血清IL-17、IL-22含量的比較
對(duì)乙肝相關(guān)性肝癌患者血清IL-17和IL-22濃度與肝功能做相關(guān)性分析,結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3a和圖3b可知,觀察組血清中IL-17濃度與堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(gamma glutamyl transferase, GGT)水平呈正相關(guān)(P<0.05);同時(shí),由圖3c和圖3d可知,觀察組血清中IL-22濃度與AKP、GGT水平呈正相關(guān)(P<0.05)。
圖3 乙肝相關(guān)性肝癌患者血清IL-17、IL-22濃度與肝功能的相關(guān)性分析
對(duì)乙肝相關(guān)性肝癌患者外周血Th-17與Th-22細(xì)胞的頻率與肝功能做相關(guān)性分析,結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4a和圖4b可知,觀察組血清中Th-17細(xì)胞百分率與AKP、GGT水平呈正相關(guān)(P<0.05);同時(shí),由圖4c和圖4d可知,觀察組血清中Th-22細(xì)胞百分率與AKP、GGT水平呈正相關(guān)(P<0.05)。
乙型肝炎病毒(HBV)感染及其相關(guān)因素仍然是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題,大約有二十億人被感染,全球HBV感染者780 000例感染每年死于肝硬化和肝癌。先前的研究已經(jīng)證實(shí)了一些個(gè)體持續(xù)性HBV為無(wú)癥狀攜帶者,而其他人則為無(wú)癥狀攜帶者。在慢性期發(fā)展LC,最終發(fā)展成肝癌[9]。然而,HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。隨著全球范圍內(nèi)乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌的日益流行,確定可能導(dǎo)致這種疾病負(fù)擔(dān)的潛在可變因素變得越來(lái)越重要。
系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征常見(jiàn)于肝癌患者,表明促炎細(xì)胞因子在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[10-11]。Thl7、Th22細(xì)胞的促炎癥、促纖維化作用已經(jīng)在各種肝病均得到證實(shí)[12-14]。Th17細(xì)胞的分化需要TGFβ1和IL-6的共同作用[15-16]。Th17細(xì)胞激活后能分泌產(chǎn)生IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22及腫瘤壞死因子等,并通過(guò)這些細(xì)胞因子促進(jìn)其他炎癥介質(zhì)的釋放。IL-17能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞分泌急性期C反應(yīng)蛋白,誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞、星狀細(xì)胞等表達(dá)多種促炎因子和趨化因子[17]。
圖4 乙肝相關(guān)性肝癌患者組Th17、Th22細(xì)胞的外周頻率與肝功能的相關(guān)性分析
有研究表明,Th22細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子參與乙型肝炎病毒的感染[18],其分泌的IL-22通過(guò)與二聚體IL-22R、IL-22磷酸化激酶Jak1和Tyk2,然后激活轉(zhuǎn)錄因子STAT3,以及STAT5和STAT1[19]。IL-22-IL-22R通路參與炎癥和損傷的不同組織反應(yīng)[20]。不同的T細(xì)胞亞群(Treg 12、Th17細(xì)胞)及其相關(guān)細(xì)胞因子在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。在對(duì)多種自身免疫性疾病包括銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等研究中,均發(fā)現(xiàn)Th22細(xì)胞比例升高,并且與疾病的進(jìn)展有關(guān)[21]。IL-22與許多感染性疾病及自身免疫性疾病、慢性炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制有一定的關(guān)聯(lián),IL-22通過(guò)JAK-STAT通路與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),如結(jié)腸癌和肺癌等[22]。
在本研究中,我們收集觀察組(即乙肝相關(guān)性肝癌患者組)及對(duì)照組(即健康人)的血清樣本,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)兩組血清IL-17、IL-22的含量,比較兩組血清IL-17、IL-22的水平,并檢測(cè)患者肝功能,分析IL-17、IL-22水平與肝功能血清生化指標(biāo)的相關(guān)性。采用FC檢測(cè)兩組外周血Th17和Th22細(xì)胞的外周頻率,分析Th17、Th22細(xì)胞水平與肝功能血清生化指標(biāo)的相關(guān)性。
結(jié)果顯示,觀察組中血清IL-17、IL-22的含量以及Th17和Th22細(xì)胞的外周頻率較對(duì)照組高(P<0.05),表明乙肝相關(guān)性肝癌患者中Th17和Th22細(xì)胞表達(dá)異常,血清IL-17、IL-22的含量異常。觀察組IL-17、IL-22與血清GGT、AKP水平呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),Th17、Th22細(xì)胞百分率與血清中GGT、AKP水平呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。AKP、GGT水平可反映肝臟的功能。表明Th17、Th22細(xì)胞百分率和IL-17、IL-22含量與肝臟的損傷程度成正相關(guān),一定程度上反映肝臟的免疫炎癥程度。
總之,乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)生與Th22、Th17細(xì)胞異常表達(dá)相關(guān),可在一定程度上反映肝臟的免疫炎癥程度。Th17/Th22細(xì)胞的過(guò)度表達(dá)是導(dǎo)致乙肝相關(guān)性肝癌自身免疫功能紊亂的重要原因,可成為治療該疾病,恢復(fù)免疫功能的新靶點(diǎn)。