司曉光，張曉青，杜瑾，張愛君，曹軍瑞

自然資源部 天津海水淡化與綜合利用研究所，天津300192

目前，微生物菌粉的干燥工藝主要包括噴霧干燥和真空冷凍干燥[1]。由于真空冷凍干燥技術(shù)是利用升華原理完成物料的干燥，因此物料在干燥過程中會(huì)保持較低的溫度，對(duì)于一些溫度敏感型物質(zhì)的干燥具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，能獲得具有較高活性的產(chǎn)物，但生產(chǎn)周期較長，產(chǎn)量較小，不適合規(guī)?；纳a(chǎn)過程[2-4]。

噴霧干燥是工業(yè)生產(chǎn)中最常用的一種干燥技術(shù)，能實(shí)現(xiàn)物料干燥的連續(xù)操作，獲得的產(chǎn)品呈粉末狀，粒徑均勻，操作靈活[5]。對(duì)絕大多數(shù)微生物而言，噴霧干燥過程中的瞬間高溫和干燥脫水，會(huì)損害其生物活性和生理生化特性。因此，選擇合適的保護(hù)劑，對(duì)于保持微生物的活性具有重要意義[6-8]。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，保護(hù)劑通過改變噴霧干燥過程中的環(huán)境條件，從而減少對(duì)微生物細(xì)胞的損害[9-12]。目前，常用的保護(hù)劑主要有脫脂乳、糖類（海藻糖、β-環(huán)糊精、蔗糖等）、醇類（甘露醇等）、氨基酸類、無機(jī)鹽類等。本研究選取了最常用的4種保護(hù)劑進(jìn)行研究，即脫脂乳、海藻糖、β-環(huán)糊精、谷氨酸鈉。

1 材料與方法

1.1 材料

芽孢桿菌dhs-330-021為通過分子生物學(xué)改造而成的菌株，保存于本實(shí)驗(yàn)室，培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。

1.2 菌株培養(yǎng)及菌泥制備

將試管保存的芽孢桿菌dhs-330-021菌株在LB平板上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min培養(yǎng)36 h，獲得菌液；菌液8000 r/min離心10 min，去除上清液獲得沉淀；用生理鹽水洗滌沉淀3次，獲得菌泥。

1.3 噴干存活率測(cè)定

采用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法，測(cè)定噴干前菌液的活菌數(shù)和噴干后菌粉復(fù)原至原體積后菌液的活菌數(shù)，通過下式計(jì)算噴干存活率：

1.4 菌粉活菌數(shù)測(cè)定

稱取少量噴干后的菌粉，加入9 mL生理鹽水，定容至10 mL，充分混勻，稀釋不同的梯度進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，按下式計(jì)算菌粉活菌數(shù)：

1.5 保護(hù)劑篩選

采用BUCHI Mini Spray Dryer B-290噴霧干燥儀進(jìn)行噴干保護(hù)劑的優(yōu)化，選擇脫脂乳、海藻糖、β-環(huán)糊精和谷氨酸鈉作為保護(hù)劑，分別配制不同的濃度梯度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，進(jìn)口溫度100℃，出口溫度50～60℃，進(jìn)樣速度2～4 mL/min，測(cè)定噴干菌粉的噴干存活率和菌粉活菌數(shù)。

1.6 菌粉穩(wěn)定性研究

選擇最佳保護(hù)劑比例，通過噴霧干燥工藝制備菌粉，噴霧干燥操作條件為進(jìn)口溫度100℃、出口溫度50～60℃、進(jìn)樣速度2～4 mL/min，將菌粉于室溫貯存30、60、90、120、150和180 d，分別取樣測(cè)定活菌數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫脂乳優(yōu)化

取離心獲得的菌粉，分別添加2%、4%、6%、8%、10%、12%和14%的脫脂乳，混合均勻，加入生理鹽水復(fù)溶后進(jìn)行噴霧干燥，操作條件為進(jìn)口溫度100℃、出口溫度50～60℃、進(jìn)樣速度2～4 mL/min，分別測(cè)定噴干存活率和菌粉活菌數(shù)，結(jié)果如圖1。添加脫脂乳后，芽孢桿菌dhs-330-021噴干后的存活率顯著提高，添加量為10%時(shí)存活率最高，為49.8%，隨著脫脂乳添加量的增大，存活率略有下降。通過測(cè)定噴干菌粉的活菌數(shù)發(fā)現(xiàn)，隨著脫脂乳含量的增加，菌粉活菌數(shù)先增加后降低，最大值在10%時(shí)，活菌數(shù)為1.59×109CFU/g。根據(jù)已有報(bào)道，脫脂乳中的蛋白類在高溫下可以發(fā)生變性，從而將菌體包裹起來免受高溫?fù)p傷，提高存活率。

2.2 海藻糖優(yōu)化

取離心獲得的菌粉，分別添加2%、4%、6%、8%和10%的海藻糖，混合均勻，加入生理鹽水復(fù)溶后進(jìn)行噴霧干燥，操作條件為進(jìn)口溫度100℃、出口溫度50～60℃、進(jìn)樣速度2～4 mL/min，分別測(cè)定噴干存活率和菌粉活菌數(shù)，結(jié)果如圖2。隨著海藻糖含量的增大，芽孢桿菌dhs-330-021的噴干存活率和菌粉活菌數(shù)均呈先增加后降低的趨勢(shì)。海藻糖添加量為6%時(shí)，噴干存活率和菌粉活菌數(shù)均最大，分別為39.7%和0.97×109CFU/g。研究表明，糖類物質(zhì)發(fā)揮保護(hù)作用的基團(tuán)主要是羥基。在細(xì)胞脫水過程中，糖類的羥基與水進(jìn)行置換，從而保護(hù)細(xì)胞膜和胞內(nèi)物質(zhì)免受損傷。此外，多元醇類所含的羥基也可以作為保護(hù)劑，如甘露醇、聚乙二醇、甘油等。

2.3 β-環(huán)糊精優(yōu)化

取離心獲得的菌粉，分別添加5%、7%、9%、11%、13%、15%和17%的β-環(huán)糊精，混合均勻，加入生理鹽水復(fù)溶后進(jìn)行噴霧干燥，操作條件為進(jìn)口溫度100℃、出口溫度50～60℃、進(jìn)樣速度2～4 mL/min，分別測(cè)定噴干存活率和菌粉活菌數(shù)，結(jié)果如圖3。添加β-環(huán)糊精后，芽孢桿菌dhs-330-021的存活率和活菌數(shù)均呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)添加量為13%時(shí)，噴干存活率和菌粉活菌數(shù)均達(dá)到最大值，分別為46.5%和1.31×109CFU/g。β-環(huán)糊精也稱環(huán)七糖，內(nèi)部基團(tuán)呈疏水性，外部的羥基具有親水性，特殊的分子結(jié)構(gòu)使其成為一種具有生物相容性的輔料。此外，β-環(huán)糊精不具有吸濕性，獲得的菌粉不易吸潮，利于保存和運(yùn)輸。

2.4 谷氨酸鈉優(yōu)化

圖1 脫脂乳添加量對(duì)芽孢桿菌dhs-330-021活性的影響

圖2 海藻糖添加量對(duì)芽孢桿菌dhs-330-021活性的影響

圖3 β-環(huán)糊精添加量對(duì)芽孢桿菌dhs-330-021活性的影響

取離心獲得的菌粉，分別添加7%、9%、11%、13%、15%和17%的谷氨酸鈉，混合均勻，加入生理鹽水復(fù)溶后進(jìn)行噴霧干燥，操作條件為進(jìn)口溫度100℃、出口溫度50～60℃、進(jìn)樣速度2～4 mL/min，分別測(cè)定噴干存活率和菌粉活菌數(shù)，結(jié)果如圖4。添加谷氨酸鈉后噴干存活率均能達(dá)到20%以上，添加量為15%時(shí)存活率最大，為43.7%。菌粉活菌數(shù)最大為1.03×109CFU/g，并且獲得的菌粉沒有黏壁和結(jié)塊現(xiàn)象，菌粉性狀較好。谷氨酸鈉可以發(fā)揮抗氧化作用，保護(hù)細(xì)胞在噴干過程中不被氧化，而且能與水結(jié)合，使菌粉保持一定的水分，維持細(xì)胞的最低生命需求。

2.5 菌粉穩(wěn)定性研究

優(yōu)良的菌粉不僅要有高的活菌數(shù)，而且還應(yīng)具備一定的穩(wěn)定性，在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中能保持活性。采用優(yōu)化后的保護(hù)劑比例，對(duì)芽孢桿菌dhs-330-021進(jìn)行噴霧干燥，獲得的菌粉置于室溫保存，每隔30 d測(cè)定菌粉的活菌數(shù)，結(jié)果見圖5。最初活菌數(shù)為1.38×109CFU/g，保存30 d后仍具有較高的活菌數(shù)，為1.27×109CFU/g，保存180 d后活菌數(shù)仍能達(dá)到1.03×109CFU/g，較最初活菌數(shù)仍有74.6%的存活率，可以認(rèn)為該菌粉的穩(wěn)定性較好。

2.6 結(jié)論

圖4 谷氨酸鈉添加量對(duì)芽孢桿菌dhs-330-021活性的影響

芽孢桿菌dhs-330-021是一株產(chǎn)抑藻活性物質(zhì)的菌株，在有害藻華的治理中具有很大的應(yīng)用前景。通過研究其噴霧干燥過程中不同保護(hù)劑的效果，選擇脫脂乳、海藻糖、β-環(huán)糊精和谷氨酸鈉作為保護(hù)劑，可明顯地提高菌粉的活菌數(shù)，延長保存時(shí)間。噴霧干燥過程中的保護(hù)劑通常由多種保護(hù)劑復(fù)配而成，這樣可以發(fā)揮各種保護(hù)劑的優(yōu)勢(shì)。比如，有些大分子保護(hù)劑通過將菌體包裹起來發(fā)揮保護(hù)作用，并且能增強(qiáng)低分子保護(hù)劑的作用，協(xié)同發(fā)揮作用[13-15]。

噴霧干燥技術(shù)所需設(shè)備簡單，成本較低，并且具備大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)，因此是微生物及其活性產(chǎn)物產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的方向[16-18]。本研究通過噴霧干燥工藝將芽孢桿菌dhs-330-021發(fā)酵液制成菌粉，菌粉活菌數(shù)達(dá)1.38×109CFU/g，噴干過程中菌的存活率也能達(dá)到65.9%，保存6個(gè)月后活菌數(shù)為1.03×109CFU/g，菌粉的穩(wěn)定性較好。

圖5 菌粉活菌數(shù)隨時(shí)間變化曲線