黃秀娜，鄺振展，肖斌，張志英，孫朝暉，李林海

中國人民解放軍 南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，廣東 廣州510010

KCNN1（potassium calcium-activated channel subfamily N member 1，Mr=59.98×103）是小電導(dǎo)鈣激活鉀離子通道（small-conductance calciumactivated K+channels，SKCa，又名KCNN）家族成員，是一種細(xì)胞膜蛋白，通常表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)膜及細(xì)胞內(nèi)膜上。KCNN1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的研究已較為深入，但是其在周圍組織腫瘤中發(fā)揮怎樣的生物學(xué)效應(yīng)仍未知。最新研究發(fā)現(xiàn)KCNN1與細(xì)胞骨架肌動蛋白絲共定位，但其與細(xì)胞骨架蛋白的作用關(guān)系還不清楚。為便于研究KCNN1的免疫生物學(xué)功能，首先必須獲得純化的重組KCNN1蛋白。本課題組在前期研究中已利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)純化了KCNN1的胞內(nèi)區(qū)段，然而原核表達(dá)的KCNN1胞內(nèi)區(qū)沒有翻譯后修飾特征，無法全面反映KCNN1的生物學(xué)特性，而大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)全長膜蛋白也具有極大的難度。本研究中，我們擬采用桿狀病毒轉(zhuǎn)化后在真核細(xì)胞Sf9中表達(dá)膜蛋白KCNN1全長，為進(jìn)一步探索KCNN1的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Sf9細(xì)胞、大腸桿菌DH10Bac和TOP10感受態(tài)、桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFast-bacI購自南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司；PfuDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、T4DNA連接酶購自大連寶生物工程有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin購自In?vitrogen公司；DNA割膠回收試劑盒及小型質(zhì)粒抽提試劑盒購自Axygen公司；DNA分子標(biāo)準(zhǔn)物購自北京天根生物科技有限公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Thermo公司；Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱購自Bio-Rad公司；昆蟲細(xì)胞裂解液購自Novagen公司；KCNN1抗體購自Abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自博奧派克生物公司；HD-核酸蛋白檢測儀購自南京普陽科學(xué)儀器研究所；PCR儀購自A&B公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)購自Thermo公司；超聲波破碎儀購自寧波新芝生物科技有限公司；DNA電泳儀、蛋白質(zhì)電泳儀、凝膠成像儀購自Bio-Rad公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)KCNN1基因序列（NCBI ID：NM_0022 48.4）設(shè)計(jì)正義引物（5'CGCGGATCCGCCACCATG AACTCCCACTCCTACA3'）和反義引物（5'CCCAA GCTTTTAGTGATGGTGGTGGTGGTGACCGCAGTCGC TTGGAGCC3'）（下劃線序列為限制酶酶切位點(diǎn)，斜體序列為蛋白C端加入的6×His標(biāo)簽），由南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增該基因全長序列（PCR參數(shù)及程序設(shè)定：94℃預(yù)變性5 min；94℃變 性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。4℃保存）。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用DNA純化試劑盒回收純化。

1.3 桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFast-bacI-KCNN1的構(gòu)建和鑒定

純化后的PCR產(chǎn)物和pFast-bacI載體分別用BamHⅠ和HindⅢ于37℃雙酶切后回收純化，加入T4DNA連接酶，16℃恒溫水浴鍋過夜。將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)TOP10菌株，經(jīng)培養(yǎng)增菌后挑取陽性克隆抽提質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定后，送廣州艾基生物技術(shù)有限公司測序，將陽性質(zhì)粒命名為pFast-bacI-KCNN1（圖1）。

1.4 桿狀病毒穿梭質(zhì)粒reBacmid-KCNN1的構(gòu)建和鑒定

將pFast-bacI-KCNN1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆菌，擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，PCR鑒定reBacmid-KCNN1是否構(gòu)建成功。PCR引物采用桿狀病毒穿梭質(zhì)粒Bacmid的M13通用上下游引物（M13正向引物：5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3'；M13反向引物：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'）。

1.5 reBacmid-KCNN1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞

將1μg重 組 質(zhì) 粒reBacmid-KCNN1（約5 μL）和6μL轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin分別加入100μL不完全Grace昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中稀釋混勻，然后將2種稀釋液合并混勻（總體積約210μL），室溫孵育30 min后加入800μL不完全Grace昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，混勻后加入處于對數(shù)生長期的Sf9昆蟲細(xì)胞中，27℃培養(yǎng)箱孵育5 h后去除轉(zhuǎn)染液，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)箱孵育72 h，收集上清作為第一代重組病毒，經(jīng)2次傳代得到高效價(jià)種病毒株。

圖1 pFast-bacI-KCNN1載體構(gòu)建模式

1.6 重組KCNN1的檢測及純化

用2次傳代后的重組病毒株感染Sf9昆蟲細(xì)胞，48 h后離心收集細(xì)胞沉淀，用昆蟲細(xì)胞裂解液將細(xì)胞沉淀完全重懸，裂解液中加入了蛋白酶抑制劑、Triton X100、NP-40等膜蛋白助溶劑；然后將細(xì)胞懸液超聲波破碎（250 W，間隔6 s工作3 s，持續(xù)3 min），之后12 000 r/min離心超聲波破碎后的產(chǎn)物15 min，收集上清，吸取20μL制備Western印跡。Western印跡使用5%脫脂奶粉作為封閉液，一抗為兔源性KCNN1抗體，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，均采用封閉液稀釋。

1.7 重組KCNN1的檢測及純化

用Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱將超聲波破碎產(chǎn)物上清中的目的蛋白親和純化。將Tris平衡過的Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱加到收集的上清中，在旋轉(zhuǎn)孵育器上4℃孵育4 h；隨后利用低壓層析系統(tǒng)，將樣品與Ni柱孵育后的混合體緩慢加入純化空柱中；用平衡緩沖液（50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，pH8.0）以0.5 mL/min的流速平衡Ni柱，直至流出液D280nm值到達(dá)基線；最后用Ni-IDA洗脫緩沖液（300 mmol/L咪唑，50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，pH8.0）以1 mL/min的流速洗脫目的蛋白，收集流出液。將上述收集的蛋白溶液加入透析袋，用50 mmol/L Tris、300 mmol/L NaCl（pH8.0）孵育過夜，進(jìn)行透析純化濃縮；用10% SDS-PAGE分析純化后的蛋白。另外，用Western印跡驗(yàn)證純化后的蛋白，一抗為兔源性KCNN1抗體，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG。

2 結(jié)果

2.1 pFast-bacI-KCNN1載體構(gòu)建

PCR擴(kuò)增KCNN1目的基因，將PCR產(chǎn)物純化后與pFast-bacI質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)，隔天挑單克隆菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，14 h后抽提菌液質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后進(jìn)行核酸電泳鑒定，并送公司測定基因序列。測序結(jié)果經(jīng)Blast比對分析，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒中插入的外源基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫的KCNN1基因編碼區(qū)序列完全一致，說明KCNN1編碼序列成功插入pFast-bacI質(zhì)粒（序列略），隨后的核酸電泳鑒定結(jié)果也顯示構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后出現(xiàn)2條帶，1700 bp左右的條帶與KCCN1基因大小相符（圖2）。說明pFast-bacI-KCNN1重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒reBacmid-KCNN1的構(gòu)建

將pFast-bacI-KCNN1轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac，經(jīng)藍(lán)白斑篩選挑取陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，14 h后抽提質(zhì)粒，用M13通用引物PCR鑒定重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒reBacmid-KCNN1是否構(gòu)建成功。結(jié)果顯示陽性克隆質(zhì)?？蓴U(kuò)增出約4.8 kb的條帶，長度略小于重組質(zhì)粒pFast-bacIKCNN1（4776+1632 bp），而藍(lán)斑產(chǎn)物的PCR產(chǎn)物約為300 bp，與空質(zhì)粒Bacmid的PCR結(jié)果相似（圖3）。結(jié)果顯示穿梭質(zhì)粒成功插入了供體質(zhì)粒的基因DNA，表明重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒reBac?mid-KCNN1構(gòu)建成功。

2.3 Western印跡檢測重組KCNN1的表達(dá)

采用Western印跡在Sf9細(xì)胞裂解上清中檢測到重組KCNN1，而在Sf9昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)上清中沒有檢測到，表明重組KCNN1表達(dá)于Sf9細(xì)胞內(nèi)，而且證實(shí)該蛋白不能分泌到細(xì)胞外，說明在昆蟲細(xì)胞內(nèi)它不是一個(gè)分泌性的蛋白（圖4）。

圖2 重組pFast-bacI-KCNN1質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.4 重組KCNN1的親和層析純化及鑒定

用Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱純化重組KCNN1，然后經(jīng)SDS-PAGE及考馬斯亮藍(lán)染色鑒定，結(jié)果如圖5，在目標(biāo)蛋白位置上，流出液泳道無明顯條帶，而洗脫液泳道只在該位置出現(xiàn)特異性條帶，表明細(xì)胞裂解液上清經(jīng)Ni柱親和層析后可以順利獲得較純的重組KCNN1。Western印跡證實(shí)純化后的蛋白是重組KCNN1（圖6）。

3 討論

KCNN家族蛋白廣泛分布于各種不同類型的組織或細(xì)胞中，如大腦[1]、胰島細(xì)胞[2]、心肌細(xì)胞[3]、內(nèi)皮細(xì)胞等[4]。KCNN家族蛋白的活性受細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的調(diào)控，具有K+選擇性、Ca2+高敏性和電壓不依賴等特性，主要介導(dǎo)神經(jīng)元慢后超極化電位的釋放，調(diào)節(jié)神經(jīng)興奮性。KCNN家族蛋白與酒精、尼古丁和藥物成癮有關(guān)[5]，其異常表達(dá)常見于帕金森病、中風(fēng)、精神分裂癥等疾病，是神經(jīng)退行性疾病有前景的治療靶標(biāo)[6-7]。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)KCNN家族蛋白各亞型能在多種組織來源的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，對腫瘤的各種生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)控，被廣泛認(rèn)為是一類有前途的腫瘤治療靶標(biāo)。目前關(guān)于KCNN家族蛋白各亞型在周圍組織腫瘤中的研究多集中于KCNN2和KCNN3。KCNN2是前列腺癌中重要的致癌基因，雄激素受體及Myc是其關(guān)鍵下游信號分子[8]，另有報(bào)道稱蛋白激酶A可以使KCNN2的Ser568/Ser570位點(diǎn)磷酸化，進(jìn)而影響KCNN2的表達(dá)[9]。KCNN3是乳腺癌的促癌基因，它高表達(dá)于乳腺癌組織，卻在正常乳腺組織中不表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)它的過表達(dá)能夠促進(jìn)體內(nèi)或體外的乳腺癌的增殖及遷移[10]。然而除了KCNN2和KCNN3，其他各亞型KCNN在腫瘤生物學(xué)行為中的作用及其分子調(diào)控機(jī)制仍然所知甚少，亟待更進(jìn)一步的研究。

圖3 重組穿梭質(zhì)粒reBacmid-KCNN1的PCR鑒定

圖4 Western印跡檢測重組KCNN1的表達(dá)

圖5 細(xì)胞裂解上清重組KCNN1的親和層析純化

圖6 Western印跡鑒定親和層析純化的重組KCNN1

KCNN1作為一種膜蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)其能與細(xì)胞骨架肌動蛋白絲共定位，但其與細(xì)胞骨架蛋白間的作用關(guān)系還不清楚。為了進(jìn)一步探討KCNN1在細(xì)胞生理活動中的作用，在本研究中我們計(jì)劃制備純化的全長KCNN1蛋白。之前我們曾嘗試使用原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，但僅能夠表達(dá)出無生物學(xué)功能的KCNN1蛋白胞內(nèi)區(qū)，分析其原因可能是KCNN1膜蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，原核表達(dá)系統(tǒng)并不能充分地對蛋白進(jìn)行翻譯后修飾。在這次研究中，我們采用桿狀病毒/Sf9細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)對目的蛋白進(jìn)行表達(dá)純化。桿狀病毒/Sf9細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢是能夠?qū)δ康牡鞍走M(jìn)行糖基化等翻譯后加工，有利于保持重組目的蛋白的天然結(jié)構(gòu)及生物活性。我們運(yùn)用桿狀病毒/Sf9細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出KCCN1，并用Ni柱親和層析技術(shù)純化了重組蛋白。但本次研究所純化的重組KCNN1得率較低，分析原因可能是該膜蛋白具有多次跨膜的特性，使其很難溶出細(xì)胞膜，造成在親和層析過程中目的蛋白與Ni柱結(jié)合的效率不高。一直以來，膜蛋白的表達(dá)純化與回收都具有極大挑戰(zhàn)性，蛋白生物活性喪失和回收率不高等難題長期困擾著膜蛋白的回收利用。在后續(xù)研究中，我們將繼續(xù)優(yōu)化重組KCNN1的分離純化實(shí)驗(yàn)方案，為全長膜蛋白的分離純化提供可借鑒的經(jīng)驗(yàn)；同時(shí)，也將對重組KCNN1的生物學(xué)活性進(jìn)行鑒定，并進(jìn)一步探討KCNN1的相互作用蛋白。