劉娟，趙思源，徐小潔，楊超，張魯囡，劉佳，孫萬軍

1.火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心 血液科，北京100088；2.海軍92076部隊 衛(wèi)生隊，北京102202；3.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京100850；4.北京衛(wèi)戍區(qū)第三退休干部休養(yǎng)所，北京100039；5.解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心 感染控制科，北京100048

角質(zhì)細胞生長因子2（keratinocyte growth fac?tor-2，KGF-2），又稱成纖維細胞生長因子10（fi?broblast growth factor-10，F(xiàn)GF-10），是FGF超家族中KGF家族的一員，是一種重要的多肽類生長因子，具有很多重要的生物學(xué)功能[1]。人KGF-2基因序列由627個核苷酸構(gòu)成，可編碼含208個氨基酸殘基的單鏈多肽。KGF-2主要由間質(zhì)細胞合成，通過旁分泌作用方式，與上皮細胞細胞膜上的受體（FGFR2Ⅲb）結(jié)合，激活該受體介導(dǎo)的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，特異性促進上皮細胞的增殖、分化和遷移。由于KGF-2對許多組織的上皮細胞都具有促增殖作用，因此人們利用KGF-2這一特性研究其對上皮組織的修復(fù)作用，并積極推動其臨床應(yīng)用[2]。

KGF-2是一個重要的旁分泌信號分子，在人類發(fā)育、健康及疾病等方面扮演重要角色，尤其在器官發(fā)育、組織損傷修復(fù)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及胚胎干細胞分化等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[3-4]，若KGF-2基因發(fā)生突變，將造成胚胎發(fā)育異常，進而產(chǎn)生多種遺傳病，如淚腺和唾液腺發(fā)育不全、淚管-耳-齒-指（趾）綜合征、慢性阻塞性肺疾病[5-7]等。KGF-2基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）與人類的肢體缺陷、唇腭裂及極度近視等疾病具有顯著相關(guān)性[8-10]。KGF-2還參與胰腺癌和乳腺癌的發(fā)病過程[11-12]。隨著年齡的增長，心肌細胞越來越少，再生能力逐漸消失，但是給與成年小鼠足夠的KGF-2時可促進其心肌細胞再生，而不是心肌成纖維細胞，這一結(jié)果提示KGF-2可作為修復(fù)心臟損傷的潛在靶點[13]。肺損傷也是臨床常見疾病。采用樟腦球或博來霉素造成呼吸道上皮損傷后，誘導(dǎo)在肺遠端間質(zhì)的平滑肌祖細胞表達KGF-2，作用于Clara干細胞，促進干細胞分化、增殖，啟動上皮修復(fù)[14]。盡管KGF-2具有眾多功能，但是體外合成的KGF-2因半衰期短及熱不穩(wěn)定性等缺陷，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受限[15]。

因此，我們擬將人源KGF-2質(zhì)?？寺≈琳婧吮磉_載體，檢測其在人類腸上皮細胞中的表達水平，評估其修復(fù)功能，為持續(xù)獲得人源KGF-2提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人HEK-293T細胞系、人乳腺cDNA文庫、pXJ-40-myc載體、大腸桿菌DH5α由軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所徐小潔研究員贈送；PCR試劑、T4DNA連接酶及限制性核酸內(nèi)切酶購自Ta?KaRa公司；膠回收試劑盒購自Promega公司；質(zhì)粒提取試劑盒、GST微珠購自Pharmacia公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑VigoFect及Western印跡發(fā)光檢測試劑盒均購自威格拉斯生物技術(shù)有限公司；兔抗-甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標記的小鼠抗Myc標簽單克隆抗體購自Sigma公司；HRP標記的兔抗山羊抗體購自北京中杉金橋公司；醫(yī)用X線膠片購自廈門銳珂醫(yī)療器材有限公司；DL2000 DNA marker購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準購自北京經(jīng)科宏達生物技術(shù)有限公司；引物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成；測序由北京華大基因生物技術(shù)公司完成。

1.2 人KGF-2基因的擴增

根據(jù)NCBI網(wǎng)站的人KGF-2基因序列設(shè)計引物5'-CGGGATCCATGTGGAAATGGATACTGACAC-3'、5'-CCGCTCGAGCTATGAGTGTACCACCATTGG-3'，以乳腺文庫為模板，PCR擴增人KGF-2基因（擴增條件：95℃5 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，30個循環(huán)；72℃5 min；4℃保存產(chǎn)物）。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，將產(chǎn)物進行膠回收。

1.3 Myc-KGF-2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及雙酶切鑒定

分別配制雙酶切體系：①KGF-2的PCR產(chǎn)物40μL，BamHⅠ和XhoⅠ各2.5μL，10×K緩沖液5μL；②載體pXJ-40-myc 2μg，BamHⅠ和XhoⅠ各2.5μL，10×K緩沖液5μL，加ddH2O至總體積為50μL。將2份酶切體系放置37℃細菌培養(yǎng)箱中，4 h后直接膠回收酶切的PCR產(chǎn)物，載體經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認被切開后，再進行膠回收。

配制酶連體系：雙酶切后的PCR產(chǎn)物11.5 μL，雙酶切后的載體1μL，T4DNA連接酶1μL，T4緩沖液1.5μL。將酶連混合物在16℃酶連儀中連接4 h。將50μL大腸桿菌DH5α加入混合物中進行轉(zhuǎn)化，形成菌落后挑取單克隆；37℃振蕩培養(yǎng)1 h，進行菌液PCR，選取瓊脂糖凝膠電泳位置正確者繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒，用上述限制性內(nèi)切酶切開質(zhì)粒；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為雙條帶且位置正確的質(zhì)粒，可能是重組質(zhì)粒。將初步鑒定的質(zhì)粒送北京華大基因生物公司測序，正確無突變者為重組質(zhì)粒。

1.4 Myc-KGF-2轉(zhuǎn)染HEK-293細胞及鑒定表達

將HEK-293T細胞接種于2個6 cm的培養(yǎng)皿中，分別加入4 mL DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞密度達70%～80%時更換培養(yǎng)基，1 h后進行轉(zhuǎn)染。

期間準備轉(zhuǎn)染試劑：將10μg重組質(zhì)粒Myc-KGF-2加入0.9% NaCl中至總體積為200μL，輕輕混勻，室溫放置；將4μL轉(zhuǎn)染試劑VigoFect加入0.9% NaCl中至總體積為200μL，輕輕混勻，室溫放置；5 min后，將轉(zhuǎn)染試劑稀釋液和質(zhì)粒溶液輕輕混勻，室溫放置；15 min后，將混合液400 μL加入細胞中。用上述方法轉(zhuǎn)染pXJ-40-myc空載體作為對照。

將轉(zhuǎn)染的細胞置于培養(yǎng)箱中，4～6 h后更換培養(yǎng)基；48 h后收細胞，3000 r/min離心5 min，棄上清，加入2倍細胞量的RIPA，于冰上裂解30 min，再加入等量2×SDS上樣緩沖液，將樣品煮沸15 min后進行Western印跡。將煮沸的樣品各取7μL加入10% SDS-PAGE膠中，恒壓160 V電泳約1 h；常規(guī)電轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，以恒壓16 V電轉(zhuǎn)約1 h；用5%脫脂牛奶封閉1 h，加小鼠抗Myc標簽單克隆抗體（1∶2000），溫室孵育1 h；1×TBST洗膜3次，每次5 min；采用化學(xué)發(fā)光法顯色10 min，壓片顯影獲得Myc-KGF-2表達結(jié)果。顯影后，將該膜用1×TBST洗膜3次，每次5 min；加兔抗-GAPDH抗體（1∶2000），溫室孵育1 h；1×TBST洗膜3次，每次5 min；加HRP標記的兔抗山羊抗體（1∶2000），溫室孵育1 h；1×TBST洗膜3次，每次5 min；采用化學(xué)發(fā)光法顯色10 min，壓片顯影獲得內(nèi)參蛋白GAPDH表達結(jié)果。

1.5 Myc-KGF-2轉(zhuǎn)染FHC細胞及劃痕實驗

將FHC細胞接種于3個3.5 cm的培養(yǎng)皿中，分別加入2 mL DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），設(shè)置未轉(zhuǎn)染的親代組、轉(zhuǎn)染pXJ-40-myc的空載體組及轉(zhuǎn)染Myc-KGF-2的實驗組，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞密度達70%時更換培養(yǎng)基，1 h后進行轉(zhuǎn)染。

轉(zhuǎn)染工作液：將5μg Myc-KGF-2質(zhì)粒加入0.9% NaCl中至總體積為100μL，輕輕混勻，室溫放置；將2μL轉(zhuǎn)染試劑VigoFect加入0.9% Na?Cl中至總體積為100μL，輕輕混勻，室溫放置；5 min后，將轉(zhuǎn)染試劑稀釋液和質(zhì)粒溶液輕輕混勻，室溫放置；15 min后，將混合液200μL加入細胞中。用上述方法轉(zhuǎn)染pXJ-40-myc空載體作為對照。

將轉(zhuǎn)染的細胞置于培養(yǎng)箱中，4～6 h后更換培養(yǎng)基；次日，用槍頭比著直尺（細胞貼壁后即可），盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜，用PBS洗去劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、6、12、24 h取樣，拍照；最后收集剩余的細胞進行Western印跡，檢測目的蛋白KGF-2及內(nèi)參蛋白GAPDH的表達量。

2 結(jié)果

2.1 Myc-KGF-2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以人乳腺文庫為模板擴增出長627 bp的DNA片段，與預(yù)期的KGF-2基因大小一致（圖1）。將BamHⅠ和XhoⅠ酶切后的PCR產(chǎn)物和pXJ-40-myc載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑克隆后進行菌液PCR鑒定，若獲得與目的條帶627 bp大小接近（圖2）的片段，則認為是陽性克隆。將陽性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，雙酶切該質(zhì)粒，獲得約5000和627 bp的2條帶，初步判定該質(zhì)粒為重組的Myc-KGF-2質(zhì)粒（圖3）。DNA測序結(jié)果表明重組克隆的KGF-2序列無突變，與已知序列一致（數(shù)據(jù)略）。

2.2 Myc-KGF-2在HEK-293T細胞中的表達

將構(gòu)建的Myc-KGF-2重組質(zhì)粒和pXJ-40-myc空載體分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，24 h后提取蛋白進行Western印跡，檢測Myc-KGF-2目的蛋白及GAPDH內(nèi)參蛋白的表達。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞用Myc-HRP抗體可在相對分子質(zhì)量約23×103處檢測到明顯的特異性條帶，而轉(zhuǎn)染空載體的細胞無條帶；用GAPDH特異性抗體可在2種細胞中均檢測到相對分子質(zhì)量約37×103的條帶（圖4）。

圖1 PCR擴增人KGF-2的DNA片 段

圖2 重組質(zhì)粒Myc-KGF-2的菌液PCR結(jié)果

圖3 重組質(zhì)粒Myc-KGF-2的雙酶切鑒定

2.3 細胞劃痕實驗驗證Myc-KGF-2促進腸上皮細胞遷移

KGF-2為生長因子，可促進上皮細胞增殖、分化和遷移。用5μg Myc-KGF-2重組克隆及pXJ-40-myc空載體轉(zhuǎn)染腸上皮FHC細胞系（圖5），通過劃痕實驗驗證腸上皮細胞的遷移能力。結(jié)果顯示，Myc-KGF-2較親代組及空載體組能促進腸上皮細胞遷移（圖6）。

3 討論

KGF-2具有多種重要功能，在機體生理和病理過程中均發(fā)揮重要作用。KGF-2能夠促進山羊肌肉內(nèi)前脂肪細胞分化成脂肪[16]；KGF-2與富含亮氨酸的重復(fù)含G蛋白偶聯(lián)受體5（leucinerich repeat-containing G protein-coupled receptor 5，Lgr5）相互作用，促進小鼠味蕾的發(fā)育[17]。特發(fā)性肺纖維化病理機制之一可能是TGF-β抑制KGF-2表達，阻礙肺損傷后的上皮修復(fù)，進而導(dǎo)致肺纖維化形成[18]。血管重構(gòu)是高血壓特征性病理形態(tài)，血管平滑肌細胞功能失調(diào)是導(dǎo)致血管重塑的重要基礎(chǔ)，而KGF-2通過調(diào)控血管平滑肌細胞的增殖和遷移參與高血壓病理形成過程[19]；遺傳學(xué)研究表明，KGF-2是肺發(fā)育過程中遠端上皮的趨化因子，氣管分支形態(tài)發(fā)生需要KGF-2/FG?FR2的信號傳導(dǎo)[20]。KGF-2在腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）中高表達，在腫瘤發(fā)生過程中扮演重要角色[21]。頭頸部腫瘤患者放療后常誘導(dǎo)唾液機能減退，但在缺氧環(huán)境下的脂肪間質(zhì)干細胞可分泌KGF-2，通過FGFRPI3K信號通路發(fā)揮抗凋亡的作用，從而對放療引起的唾液機能減退起到治療作用[22]。KGF-2在代謝病中也發(fā)揮重要作用，mir-327-FGF10-FGFR2介導(dǎo)的自分泌信號控制著白色脂肪的褐變，該信號軸可能作為肥胖和代謝病的治療靶點[23]。

圖4 Myc-KGF-2重組蛋白的Western印跡

圖5 Western印跡檢測融合蛋白在FHC細胞中的表達

圖6 KGF-2促進腸上皮細胞遷移

在KGF-2的眾多功能中，其上皮修復(fù)功能受到人們關(guān)注，并應(yīng)用于臨床治療，如腸損傷治療。腸黏膜屏障是人體的重要保護屏障。一旦發(fā)生腸損傷，腸道的生物屏障作用消失，導(dǎo)致大量體液丟失和腸道內(nèi)毒性物質(zhì)進入血液，從而引起嚴重的水電解質(zhì)平衡失調(diào)及敗血癥，將會帶來多種危及生命的并發(fā)癥[24]。因此，研究腸損傷修復(fù)，對多種疾病如放射性腸損傷、應(yīng)激性腸損傷及腸道慢性疾病等具有重要意義。KGF-2對克羅恩病有很好的療效，腹腔注射KGF-2能夠避免患有克羅恩病的大鼠體重下降、腹瀉和腸道炎癥，促進腸上皮細胞生長[25]。KGF-2對輻射所致肺、胃腸道組織損傷的修復(fù)及免疫重建具有重要作用，歐洲相關(guān)工作組已將KGF-2納入急性放射病的救治方案當中[26]。雖然KGF-2對上皮細胞增殖和保持腸黏膜完整性至關(guān)重要，但單純靠外源性KGF-2不能長久、有效地為病患提供保護功能。研究人員試圖尋找持續(xù)有效地傳遞KGF-2至病灶的方法[27]，但尚未得到滿意的結(jié)果。

綜上，我們將真核表達的KGF-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人FHC細胞，獲得高表達KGF-2的FHC細胞，并驗證該質(zhì)粒發(fā)揮了損傷修復(fù)的功能，為進一步研發(fā)穩(wěn)定表達KGF-2的正常細胞的功能及臨床應(yīng)用積攢了實驗依據(jù)。