賈俊婷，袁典，汪琳，馬玉媛，章金剛,2

1.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 衛(wèi)生勤務(wù)與血液研究所，北京100850；2.新鄉(xiāng)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453000

豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）是豬→人異種移植、豬源制品與生物活性材料中最受關(guān)注的病原體。它以前病毒DNA形式整合在所有豬的細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞染色體復(fù)制而復(fù)制[1-2]，可在體外感染多種人源細(xì)胞[3]。為消除PERV感染，眾多學(xué)者都希望建立無PERV豬群。但是，由于PERV存在的普遍性和廣泛性[4-5]，篩選天然無PERV陰性豬體并非易事[6]。2015年，楊璐涵等利用CRISPR-Cas9技術(shù)將豬腎細(xì)胞PK15中62個(gè)PERV-pol基因失活[7]；2017年再次實(shí)現(xiàn)將豬原代胚胎成纖維細(xì)胞中所有PERV失活，并進(jìn)一步通過體細(xì)胞核移植獲得了PERV完全失活的豬[8]。但該技術(shù)距離規(guī)?；瘧?yīng)用還有很遠(yuǎn)距離，并且還須對PERV失活基因編輯豬的生物安全性進(jìn)行長期監(jiān)測。

載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3（apolipoprotein B mRNA editing enzymecatalytic polypeptide-like 3，APOBEC3）是一種天然免疫抗病毒分子，在宿主抗病毒天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用[9-11]。豬體內(nèi)僅含有一種APOBEC3家族成員即豬APOBEC3F（pig APOBEC3F，pA3F）[12]。研究發(fā)現(xiàn)，pA3F分子可通過其胞苷脫氨酶作用有效抑制PERV的復(fù)制[13-14]。然而，Jónsson等[15]上調(diào)PK15細(xì)胞中pA3F的表達(dá)量后與人胚腎HEK293細(xì)胞共培養(yǎng)，PK15細(xì)胞中釋放的PERV仍可感染HEK293細(xì)胞，提示PERV可能對pA3F有一定的拮抗作用。揭示PERV在pA3F抗病毒作用下的免疫逃逸機(jī)制，對于尋找抗反轉(zhuǎn)錄病毒新的藥物作用靶標(biāo)有重要意義。

本研究中，我們構(gòu)建了pA3F基因的慢病毒表達(dá)載體，感染了PK15細(xì)胞，并篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)pA3F的單克隆細(xì)胞株。

1 材料與方法

1.1 材料

PK15細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞、pBPLV-flag-pA3F質(zhì)粒均為本室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、T4DNA連接酶均購自TaKaRa生物工程公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ-HF、Phusion HF DNA聚合酶購自NEB公司；pLenti-Puro-3Flag載體、Trans-fect慢病毒包裝轉(zhuǎn)染試劑購自和元生物技術(shù)公司；普通質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen公司；聚凝胺（polybrene）購自Sigma公司；DMEM Basic細(xì)胞培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基均購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；蛋白酶抑制劑購自Roche公司；RIPA細(xì)胞裂解液購自碧云天公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京鼎國昌盛公司；羊抗兔、羊抗鼠熒光二抗均購自LICOR公司；4%～20%預(yù)制梯度膠購自南京金斯瑞公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇、無水甲醇等購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；蛋白預(yù)染marker購自Thermo fisher公司；封閉液購自Rockland公司；PVDF膜購自Merck Millipore公司；Flag標(biāo)簽 抗 體購自Cell Signaling Technology公司；豬β-actin抗體購自proteintech公司。

1.2 pLenti-Puro-pA3F-3Flag質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

以pBPLV-flag-pA3F質(zhì)粒為模板，用引物F（5'-TGAACCGTCAGATCGAATTCGCCACCATGGA TCCTCAGCGCCTG-3'）和R（5'-TCATCGTCATCCT TGTAGTCGAATTCTCTCGAGTCACTTCTTGATGAT G-3'）PCR擴(kuò) 增pA3F基因，膠回收純化PCR產(chǎn)物。pA3F基因PCR產(chǎn)物和pLenti-Puro-3Flag空載體分別經(jīng)EcoRⅠ單酶切，酶切產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐西林抗性篩選后，采用菌落PCR篩選陽性克隆，挑取陽性單菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后測序鑒定。

1.3 慢病毒的包裝

將生長狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，次日細(xì)胞匯合度達(dá)70%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 h，去除原有細(xì)胞培養(yǎng)基，更換為Opti-MEM培養(yǎng)基。將待轉(zhuǎn)染的pLenti-PuropA3F-3Flag重組質(zhì)?；蚩蛰d體與包裝質(zhì)粒（pLP1、pLP2、pLP/VSVG組成的packaging mix）以1∶1的比例溶于Opti-MEM培養(yǎng)基，總體積為500 μL，輕輕混勻，靜置5 min；將Trans-fect慢病毒包裝轉(zhuǎn)染試劑溶于Opti-MEM培養(yǎng)基，總體積為500μL，輕輕混勻，靜置5 min；將轉(zhuǎn)染試劑稀釋液滴加到質(zhì)粒稀釋液中，邊加邊輕輕混勻，室溫放置20 min；去除細(xì)胞培養(yǎng)基，將配好的DNA-轉(zhuǎn)染試劑混合液緩慢加到細(xì)胞層表面，輕輕混勻；培養(yǎng)6～8 h后去除培養(yǎng)基，添加10 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；分別于轉(zhuǎn)染后48、72 h收集細(xì)胞上清，3500 r/min離心10 min，用0.22μm濾膜過濾上清到超速離心管中；4℃、30 000 r/min離心2 h，棄上清，用預(yù)冷的DPBS重懸沉淀，分裝后保存于-70℃冰箱。

1.4 慢病毒滴度測定

將生長狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞以1×105/孔接種于24孔板，細(xì)胞貼壁后加入待測病毒，每個(gè)病毒樣品各加3個(gè)孔，病毒量分別為0.1、1和10 μL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12～20 h后換液，去掉含病毒的培養(yǎng)基，72 h后提取細(xì)胞基因組DNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定病毒載體特定元件WPRE的拷貝數(shù)。病毒滴度（transducing units/mL，TU/mL）=（平均每基因組整合的病毒序列拷貝數(shù)×感染時(shí)細(xì)胞數(shù)目×1000）/加入的病毒體積（mL）。

1.5 慢病毒感染PK15細(xì)胞

將生長狀態(tài)良好的PK15細(xì)胞以2×105/皿接種于共聚焦小皿中，待細(xì)胞達(dá)到30%～40%匯合度時(shí)棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌3～5次，按照MOI=100，將一定體積的pLenti-Puro-pA3F-3Flag病毒液或?qū)φ詹《疽杭尤牍簿劢剐∶?，每皿加?μg/mL聚凝胺，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每30 min均勻搖晃共聚焦小皿，2 h后補(bǔ)加1.5 mL含10%胎牛血清的正常培養(yǎng)基，感染12～24 h后棄去培養(yǎng)基，每皿加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 Western印跡檢測蛋白表達(dá)

收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS漂洗3次后離心棄掉上清，用50μL含蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液重懸和裂解細(xì)胞沉淀，并進(jìn)行超聲波破碎，4℃、14 000 r/min離心5 min，收集上清；用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，加入適當(dāng)體積5×上樣緩沖液，混勻并煮沸10 min；每個(gè)樣品各取80μg進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用封閉液于室溫孵育1 h；去除封閉液，用1∶1000稀釋的小鼠抗Flag抗體或抗內(nèi)參蛋白抗體孵育PVDF膜，4℃輕搖過夜；用TBST液洗膜3次，每次10 min；用1∶10 000稀釋的羊抗小鼠熒光二抗室溫孵 育PVDF膜1 h，TBST液 洗 膜3次，每 次10 min；用紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃膜成像。

1.7 嘌呤霉素聯(lián)合有限稀釋法篩選穩(wěn)定表達(dá)pA3F的PK15細(xì)胞單克隆株

將慢病毒感染的PK15細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后用含2.5μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基）進(jìn)行藥物篩選培養(yǎng)，18 d后出現(xiàn)細(xì)胞集落；消化細(xì)胞集落后計(jì)數(shù)，用含2.5μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞密度約為1×103/mL；96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板的第3～11排每孔添加0.1 mL含2.5μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基，將上述單細(xì)胞懸液接種于第2排，0.2 mL/孔，從中吸取0.1 mL細(xì)胞懸液接種于第3排，混合后，從第3排中吸取0.1 mL接種于第4排，以此類推，直至第11排，挑選只有1～2個(gè)細(xì)胞的孔進(jìn)而挑選單克隆細(xì)胞；待單細(xì)胞生長成為集落后依次轉(zhuǎn)入48、24和6孔板增殖培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 pLenti-Puro-pA3F-3Flag質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以pBPLV-flag-pA3F質(zhì)粒為模板擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳可見1000～2000 bp的特異性條帶（圖1），與pA3F基因（約1254 bp）大小相符，初步確定擴(kuò)增到pA3F基因。純化的PCR產(chǎn)物與pLenti-Puro-3Flag空載體分別經(jīng)EcoRⅠ酶切后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR篩選陽性克隆并測序鑒定，結(jié)果顯示與GenBank公布的pA3F基因序列一致，確定pLenti-Puro-pA3F-3Flag重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 pLenti-Puro-pA3F-3Flag質(zhì)粒的表達(dá)與鑒定

將pLenti-Puro-pA3F-3Flag重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，同時(shí)設(shè)空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞和正常培養(yǎng)細(xì)胞分別作為陰性對照和空白對照。48 h后提取細(xì)胞蛋白，Western印跡檢測pA3F蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pLenti-Puro-pA3F-3Flag質(zhì)粒的細(xì)胞在相對分子質(zhì)量43×103～55×103的蛋白marker條帶之間有單一蛋白條帶，與pA3F-3Flag融合后的預(yù)測蛋白大?。?8×103）相符，而對照組均未見目的蛋白條帶（圖2）。表明構(gòu)建的pLenti-Puro-pA3F-3Flag重組質(zhì)?？梢栽贖EK293T細(xì)胞中表達(dá)pA3F蛋白。

2.3 慢病毒的包裝與鑒定

在HEK293T細(xì)胞中包裝pLenti-Puro-pA3F-3Flag重組質(zhì)粒和空載體，分別命名為Lenti-pA3F和Lenti-Control，測得病毒濃縮液滴度分別為1.32×108和1.34×109TU/mL。將Lenti-pA3F和Len?ti-Control感染PK15細(xì)胞（MOI=100），96 h后收集細(xì)胞，Western印跡檢測Lenti-pA3F感染組細(xì)胞為pA3F高表達(dá)，Lenti-Control感染組細(xì)胞pA3F不表達(dá)（圖3）。

圖1 pA3F基因擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜

圖2 Western印跡檢測pLenti-Puro-pA3F-3Flag質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)

2.4 穩(wěn)定表達(dá)pA3F的PK15細(xì)胞單克隆株篩選與鑒定

將Lenti-pA3F感染的PK15細(xì)胞接種于96孔板中，通過嘌呤霉素壓力篩選并結(jié)合有限稀釋法篩選穩(wěn)定表達(dá)pA3F的單克隆細(xì)胞。Western印跡顯示，篩選到的PK15細(xì)胞單克隆株2C和2D均可檢測到pA3F的表達(dá)，單克隆株2D的pA3F表達(dá)水平明顯高于2C（圖4）。

3 討論

APOBEC3屬于胞苷酸脫氨酶家族，是宿主內(nèi)存在的一種具有抗多種病毒作用的天然抗病毒分子[16]。已證實(shí)其家族成員A3F與A3G均可有效阻止內(nèi)源性與外源性反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制，對Vif缺陷的人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的抑制尤為明顯。Vif缺陷的HIV-1病毒株在非允許細(xì)胞中復(fù)制時(shí)，A3F/A3G可被包裝入新裝配的子代病毒粒子中，在新感染的細(xì)胞中通過使HIV-1反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的負(fù)鏈cDNA發(fā)生C→U突變，導(dǎo)致病毒基因組DNA量下降，并抑制病毒的復(fù)制與感染[17-19]。但是慢病毒所含的Vif蛋白可通過屏蔽A3F/A3G的病毒結(jié)合區(qū)域，從而阻止A3F/A3G包裝進(jìn)入病毒體內(nèi)；也可以通過泛素-蛋白酶體途徑降解A3F/A3G[20-23]，導(dǎo)致其無法及時(shí)包裝進(jìn)入新生的子代病毒粒子中，從而使子代病毒負(fù)鏈cDNA上的C免遭脫氨作用。

圖3 Western印跡檢測慢病毒感染PK15細(xì)胞中pA3F的表達(dá)

圖4 Western印跡檢測慢病毒感染PK15細(xì)胞單克隆株中pA3F的表達(dá)

PERV本身并不編碼Vif蛋白，在自然宿主體內(nèi)逃逸pA3F作用的機(jī)制尚不清楚。結(jié)合文獻(xiàn)及前期結(jié)果，推測PERV中可能存在其他某種蛋白具備Vif樣活性，或借助某種機(jī)制促成了pA3F在發(fā)揮作用前被降解，由此逃逸了pA3F的抗病毒作用。為篩選與pA3F互作的病毒效應(yīng)蛋白及宿主細(xì)胞關(guān)鍵蛋白，須首先構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)pA3F的PK15細(xì)胞系。

慢病毒載體基于HIV-1發(fā)展而來，具有基因轉(zhuǎn)染效率高、宿主范圍廣、對人致病性低、可同時(shí)感染分裂期和非分裂期細(xì)胞、可整合入基因組實(shí)現(xiàn)長時(shí)間表達(dá)等特點(diǎn)，這些獨(dú)特優(yōu)勢使其在分子、細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛認(rèn)可和應(yīng)用[24]。本研究中使用的pLenti-Puro-3Flag載體為四質(zhì)粒系統(tǒng)，是目前被廣泛使用的慢病毒載體系統(tǒng)，具有較高的感染性和安全性。我們采用常規(guī)分子克隆技術(shù)構(gòu)建pLenti-Puro-pA3F-3Flag質(zhì)粒，將該質(zhì)粒與包裝載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，包裝成可感染PK15細(xì)胞的Lenti-pA3F慢病毒，并通過嘌呤霉素壓力篩選并結(jié)合有限稀釋法篩選穩(wěn)定高表達(dá)pA3F的PK15細(xì)胞單克隆株。此外，研究期間還曾嘗試使用另2種慢病毒載體（pLOV-EF1a-PuroR-CMV-EGFP-P2A-3FLAG載 體 和pBPLV載體）進(jìn)行pA3F假病毒的包裝，但包裝的病毒液感染效率明顯低于用pLenti-Puro-3Flag載體包裝的慢病毒（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。

穩(wěn)定表達(dá)pA3F的PK15細(xì)胞單克隆株的建立，為進(jìn)一步深入研究PERV在pA3F作用下的免疫逃逸機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。