吳菲，靳輸梅，李曉艷，邱煒，楊國菊，張婷娟，齊家龍，繆嬌麗，趙紅宇

1.云南省第三人民醫(yī)院，云南 昆明650000；2.云南省藥物研究所，云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明650000；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明650000；4.云南省華寧縣人民醫(yī)院，云南 昆明650000

吸煙是慢性阻塞性肺病[1]、動(dòng)脈粥樣硬化[2]和心血管疾病[3]的主要危險(xiǎn)因素。尼古丁是香煙煙霧中的主要成分之一，是N膽堿受體激動(dòng)劑，會(huì)使人上癮并產(chǎn)生依賴性[4]。研究表明香煙煙霧提取物能夠誘導(dǎo)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而形成肺動(dòng)脈高壓[5]。尼古丁通過激活NLRP3炎癥小體，誘導(dǎo)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生[6]。尼古丁能夠誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞自噬，參與牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程[7]。同時(shí)，尼古丁可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生中性粒細(xì)胞外捕獲網(wǎng)[8]，與吸煙相關(guān)的疾病息息相關(guān)[9]。

細(xì)胞自噬是一種機(jī)體自我保護(hù)的程序性死亡，是真核細(xì)胞通過降解途徑維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，在人體生理中起重要作用，尤其是在抗微生物感染、衰老和神經(jīng)退行性疾病方面[10]。通過多種方式誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，也是抗癌治療的一種手段[11]。與此同時(shí)，細(xì)胞自噬在先天免疫中也發(fā)揮重要作用，宿主可以通過自噬-溶酶體降解途徑保護(hù)機(jī)體免受細(xì)菌感染[12]，如結(jié)合分枝桿菌、沙門菌及土拉弗朗西斯菌等。先天免疫細(xì)胞中，尤為重要的是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，其在抗微生物感染方面起到了重要的作用[13]。

尼古丁可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡和自噬的發(fā)生，而尼古丁與巨噬細(xì)胞吞噬功能和肺炎的關(guān)系尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在探討尼古丁與巨噬細(xì)胞的功能和肺炎發(fā)生的關(guān)系，結(jié)果表明自噬能夠誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞MH-S發(fā)生自噬并且呈劑量依賴性，尼古丁處理能夠增強(qiáng)LC3BⅡ的表達(dá)，通過電鏡觀察也能看到大量自噬體的出現(xiàn)。中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)表明，尼古丁誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞的自噬，影響了巨噬細(xì)胞的吞噬功能。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，尼古丁可以誘導(dǎo)肺部炎癥的發(fā)生。本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了尼古丁誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞的自噬以及肺炎的關(guān)系，為探討香煙煙霧暴露對(duì)肺相關(guān)疾病的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》；肺泡巨噬細(xì)胞系MH-S購自昆明泉港生物科技有限公司。

戊二醛、牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma公司；Hoechst33258、碘化丙啶（PI）、中性紅粉末、H&E染色試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、TC處理細(xì)胞爬片及TMB單組分顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；PBS、胎牛血清（FBS）、RPMI1640培養(yǎng)基購自BI公司；IL-6、IL-1、TNF-α配對(duì)抗體購自eBioscience公司；抗LC3B抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光底物購自Thermofish公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

MH-S細(xì)胞用含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素、1%非必需氨基酸的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)并將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞于實(shí)驗(yàn)前1 d以1×106/孔的密度鋪板。

1.3 尼古丁處理

用無菌的PBS溶解尼古丁粉末，制備1 mmol/L尼古丁母液，用0.22μm的小濾器過濾除菌備用，分別用不同濃度的尼古丁緩沖液處理細(xì)胞。

1.4 Hoechst33258/PI雙染免疫熒光檢測

用無抗的RPMI1640培養(yǎng)基對(duì)24孔板的MHS細(xì)胞進(jìn)行換液，采用不同濃度的尼古丁進(jìn)行處理，6 h后去除上清，用無菌PBS清洗3次。用含10μg/mL Hoechst33258/PI的完全RPMI1640培養(yǎng)基染色15 min，在熒光顯微鏡下觀察和攝片。

1.5 Western印跡檢測細(xì)胞自噬

細(xì)胞經(jīng)處理后，用無菌PBS清洗3次，用100 μL含有蛋白酶和磷酸化酶抑制劑的RIPA裂解液提取每孔蛋白，采用Bradford法測定蛋白濃度并制備蛋白電泳樣品；按濃縮膠80 V 30 min、分離膠120 V 60 min進(jìn)行SDS-PAGE，半干法轉(zhuǎn)膜，將含有蛋白的PVDF膜置于5%脫脂奶中37℃封閉2 h，并加入抗LC3B（1∶3000）抗體，4℃封閉過夜，1×TBST清洗5次，每次5 min；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5000），37℃孵育90 min，1×TBST清洗5次，每次5 min；于成像儀上用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，采用Image J軟件分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞自噬

將1×106MH-S細(xì)胞接種于12孔板，用10 μmol/L尼古丁刺激6 h，去除上清，PBS清洗3次，收集細(xì)胞，12 000 r/min離心10 min，緩慢去除上清，用200μL 4℃預(yù)冷的戊二醛固定細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞切片，在電子顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬體的情況并統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞經(jīng)過處理后，用PBS清洗3次，加入500 μL 0.22μm過濾器過濾的0.05%中性紅溶液，染色5 min，期間觀察細(xì)胞的狀態(tài)，保證細(xì)胞的活性。染色完成后，用PBS清洗3次，將細(xì)胞外的中性紅溶液清洗干凈。加入500μL中性紅提取液（50%乙醇+1%乙酸+49%水）提取MH-S攝取的中性紅，12 000 r/min離心10 min，用分光光度計(jì)測定D540nm值，換算中性紅的攝取能力。

1.8 HE病理染色及分析

BALB/c小鼠分為對(duì)照組及攻毒組（尼古?。?，每組5只。用尼古丁滴鼻，觀察小鼠肺損傷情況，每2 d滴鼻1次，持續(xù)1周。操作前監(jiān)測小鼠體重變化，2周后處死小鼠，取小鼠左肺用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，用H&E染色試劑盒染色，顯微鏡下觀察、攝片，用Image J統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

用GraphPad Prism 7.0做圖和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)量數(shù)據(jù)用x±SD表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尼古丁誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞死亡

香煙煙霧提取物可以誘導(dǎo)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、人牙周膜細(xì)胞、心肌細(xì)胞死亡。用Hoechst33258/PI雙染色檢測尼古丁誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞的死亡情況，MH-S細(xì)胞分別用10、1、0.1μmol/L的尼古丁處理6 h，結(jié)果如圖1。隨著尼古丁劑量的增加，PI染色的死細(xì)胞數(shù)呈梯度依賴趨勢，10 μmol/L尼古丁處理6 h后，大部分細(xì)胞呈死亡狀態(tài)，因此采用1μmol/L尼古丁為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的工作濃度。

2.2 尼古丁誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生

細(xì)胞自噬是一種程序性的細(xì)胞死亡，研究表明，細(xì)胞自噬的發(fā)生與尼古丁的攝取密切相關(guān)。Western印跡結(jié)果顯示，隨著尼古丁濃度的升高，LC3BⅡ表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且升高趨勢在尼古丁濃度為10μmol/L是有所降低，可能因部分細(xì)胞已經(jīng)死亡所致。并且發(fā)現(xiàn)，尼古丁能夠明顯增強(qiáng)用LPS預(yù)處理的MH-S細(xì)胞自噬。同時(shí)采用1μmol/L尼古丁處理MH-S細(xì)胞6 h后用透射電子顯微鏡觀察，實(shí)驗(yàn)組的自噬體數(shù)量明顯高于對(duì)照組，Image J統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明尼古丁能夠增強(qiáng)細(xì)胞自噬的發(fā)生。參見圖2。

2.3 尼古丁降低巨噬細(xì)胞的吞噬能力

吞噬能力是巨噬細(xì)胞殺菌、抗病毒感染以及清除衰老壞死細(xì)胞組織最重要的環(huán)節(jié)之一。通過中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)檢測尼古丁處理后MH-S細(xì)胞的吞噬能力，結(jié)果如圖3。尼古丁作用6 h后，MH-S的吞噬能力呈劑量依賴的降低趨勢，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明尼古丁能夠明顯降低巨噬細(xì)胞的吞噬能力。

2.4 尼古丁誘導(dǎo)肺損傷發(fā)生

用尼古丁進(jìn)行小鼠鼻腔攻毒，每次50μL，劑量為10μmol/只，每2 d滴鼻1次，連續(xù)1周，同時(shí)檢測小鼠體重，結(jié)果如圖4A，與對(duì)照組相比，小鼠體重呈下降趨勢，停止攻毒后小鼠體重恢復(fù)。取攻毒組和對(duì)照組左肺進(jìn)行H&E染色（圖4B），可以明顯看到攻毒組肺部有大量炎性細(xì)胞浸潤，表明尼古丁能夠造成小鼠肺炎的發(fā)生。

3 討論

吸煙是糖尿病、心血管疾病、肺部相關(guān)疾病等的重要危險(xiǎn)因素[14]。吸煙可以引發(fā)心肌細(xì)胞、肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和自噬，香煙煙霧中最豐富和重要的成分就是尼古丁，研究表明尼古丁也會(huì)促進(jìn)多種細(xì)胞自噬發(fā)生并誘發(fā)肺相關(guān)疾病[5]。中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞是機(jī)體重要的先天免疫細(xì)胞，已有研究表明尼古丁可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生中性粒細(xì)胞捕獲網(wǎng)狀態(tài)[9]，這個(gè)過程依賴于自噬的發(fā)生[15]。本研究也表明尼古丁可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡，核酸染料PI不能穿透完整的細(xì)胞膜，而可以對(duì)壞死細(xì)胞染色。

巨噬細(xì)胞作為宿主抵抗病原微生物的第一道防線，吞噬能力是其發(fā)揮功能的重要方面[16]。傳統(tǒng)意義上，細(xì)胞自噬的發(fā)生是細(xì)胞自潔過程，不僅對(duì)胞內(nèi)菌有作用，對(duì)胞外微生物也有應(yīng)答，但異常的自噬發(fā)生也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13]。本研究發(fā)現(xiàn)外源尼古丁能夠誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞自噬的現(xiàn)象，通過Western印跡檢測LC3BⅡ的表達(dá)及透射電子顯微鏡觀察自噬體的數(shù)目均能表明自噬的發(fā)生。這種異常自噬不僅導(dǎo)致了巨噬細(xì)胞死亡，同時(shí)影響了巨噬細(xì)胞的吞噬功能，如中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)所示。并且本研究還發(fā)現(xiàn)，尼古丁誘導(dǎo)的自噬在LPS刺激下更加嚴(yán)重，表明吸煙攝入的尼古丁有可能加重感染所導(dǎo)致的肺炎。

吸煙也是慢性阻塞性肺病最重要的誘因之一[17]。慢性阻塞性肺病是一種氣流阻塞特征的慢性支氣管炎和（或）肺氣腫，可進(jìn)一步發(fā)展為肺心病和呼吸衰竭[17]。肺炎為慢性阻塞性肺病急性加重的重要誘因，慢性阻塞性肺病氣流受限不可逆，肺炎患者長期慢性感染加重后可導(dǎo)致慢性阻塞性肺病。慢性阻塞性肺病急性加重期常伴發(fā)肺部感染。本研究表明，尼古丁能有效地誘導(dǎo)小鼠發(fā)生肺炎。

本研究表明，尼古丁能夠有效地增強(qiáng)巨噬細(xì)胞細(xì)胞死亡，這種死亡過程伴隨著自噬的發(fā)生，并且能夠被LPS預(yù)刺激加強(qiáng)。與此同時(shí)，尼古丁引起的巨噬細(xì)胞自噬降低了細(xì)胞吞噬能力，這有可能抑制了宿主清除病原菌的能力。最后，本研究表明在體內(nèi)表面，尼古丁能引起小鼠發(fā)生肺炎癥狀?？傊?，本研究為進(jìn)一步探討吸煙相關(guān)肺部疾病的發(fā)病機(jī)制和治療方法提供了依據(jù)。

圖2 尼古丁誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生

圖3 尼古丁降低巨噬細(xì)胞吞噬能力

圖4 尼古丁誘導(dǎo)小鼠肺炎發(fā)生