于敏，朱占芳，劉飛，楊瑾，王英

西安交通大學(xué) 醫(yī)院，陜西 西安710049

炎癥反應(yīng)是機(jī)體應(yīng)對刺激時的一種保護(hù)性免疫反應(yīng)。機(jī)體產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)太弱就不能及時、有效地清除病原微生物，會導(dǎo)致持續(xù)性感染；而炎癥反應(yīng)過強(qiáng)則會誘發(fā)炎癥相關(guān)疾病[1]，已經(jīng)證實炎癥參與多種炎癥相關(guān)疾病如2型糖尿病[2]、痛風(fēng)[3]、腫瘤[4]等的發(fā)生發(fā)展。因此，機(jī)體內(nèi)存在嚴(yán)密的機(jī)制調(diào)控炎癥反應(yīng)的整個過程。

病原體的病原相關(guān)分子模式（pathogen-asso?ciated molecular patterns，PAMP）和機(jī)體釋放的損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMP）均能通過機(jī)體內(nèi)的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRR）或感應(yīng)系統(tǒng)啟動天然免疫系統(tǒng)、激活炎癥反應(yīng)。常見的PAMP包括脂多糖、肽聚糖、鞭毛蛋白以及一些微生物的核酸分子等，這些PAMP能夠被相應(yīng)的PRR識別進(jìn)而激活下游信號通路，引起炎癥反應(yīng)或抗菌應(yīng)答[5]。已知的PRR主要包括三類：Toll樣受體、RIG-Ⅰ樣受體和NOD樣受體（NOD like recep?tors，NLR）。其中NLR是定位于胞漿中廣泛表達(dá)的模式識別受體家族，在受到PAMP和DAMP的刺激時，一些NLR可以和凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白（apoptosis associated speck-like protein，ASC）、天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶（caspase-1）形成一種被稱作炎癥小體的多聚蛋白復(fù)合物，進(jìn)而激活下游信號通路，引起炎癥反應(yīng)。NLRP3（NLR pyrin domain-3）是NLR家族中研究最為深入的一個[6]，其被證實參與多種炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。迄今，關(guān)于NLRP3炎癥小體信號通路的調(diào)控機(jī)制還有很多未知問題有待探索。因此，研究機(jī)體對NLRP3炎癥小體信號通路的調(diào)控具有重要意義。

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的關(guān)鍵接頭蛋白，能直接或間接地與腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族和（或）白介素1（interleu?kin-1，IL-1）/Toll樣受體超家族成員結(jié)合，通過轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、JNK/p38、（PI3K）/AKT、AP-1通路的激活，影響細(xì)胞的生成、增殖、分化和死亡，調(diào)控先天性和獲得性免疫、炎癥反應(yīng)、胚胎發(fā)育、氧化應(yīng)激、骨代謝等多個生物學(xué)過程[8-9]。目前關(guān)于TRAF6對NLRP3炎癥小體信號通路調(diào)控的報道還很少。本研究揭示了TRAF6通過增加NLRP3的穩(wěn)定性，正調(diào)控NLRP3炎癥小體信號通路的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚胎腎細(xì)胞HEK-293T和人單核巨噬細(xì)胞THP-1，真核表達(dá)質(zhì)粒Myc-Vector、Myc-TRAF6、Myc-NLRP3、Flag-Vector、Flag-TRAF6和Flag-NL?RP3為西安交大醫(yī)學(xué)部保存；Myc標(biāo)簽抗體、Flag標(biāo)簽抗體、α-tubulin抗體、TRAF6抗體購自Abcam公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋生物有限公司；siTRAF6序列和作為對照的siS?cramble序 列（5'-GTGCAAGTGCAAACCAGACTT-3'）購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；Flag標(biāo)簽抗體偶聯(lián)的瓊脂糖珠、Myc標(biāo)簽抗體偶聯(lián)的磁珠、脂多糖（LPS）、腺苷三磷酸（ATP）購自Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑jetPRIME購自PolyPlus公司；培養(yǎng)基和血清購自Gibco公司；聚偏二氟乙烯膜（PVDF）、顯影液購自Millipore公司；乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱產(chǎn)自Thermo公司；蛋白質(zhì)電泳槽和電源產(chǎn)自Bio-Rad公司；旋轉(zhuǎn)孵育儀產(chǎn)自江蘇海門儀器廠；離心機(jī)產(chǎn)自Eppendorf公司；半干轉(zhuǎn)膜儀和化學(xué)發(fā)光拍照系統(tǒng)產(chǎn)自天能生物技術(shù)公司；酶標(biāo)儀產(chǎn)自Perkin Elmer公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

用含10%胎牛血清、100 mmol/L鏈霉素、100 mmol/L青霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HEK-293T細(xì)胞；用含10%胎牛血清、100 mmol/L鏈霉素、100 mmol/L青霉素的1640培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)THP-1細(xì)胞。用轉(zhuǎn)染試劑jetPRIME進(jìn)行轉(zhuǎn)染，取細(xì)胞培養(yǎng)基1/10量的轉(zhuǎn)染試劑緩沖液，向緩沖液中加入待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后漩渦混勻15 s，靜置10 min后加入jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑再漩渦混勻15 s，室溫靜置15 min后將配好的轉(zhuǎn)染液加入提前半量換液的細(xì)胞培養(yǎng)基中，4～6 h后補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)處理。

1.3 免疫共沉淀

用細(xì)胞刮子刮取細(xì)胞，4℃、3000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，再用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞3次，加入600μL NP40裂解液重懸細(xì)胞，冰上靜置20 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清。取上清的1/10用于檢測全細(xì)胞蛋白，剩余部分各加入20μL Flag瓊脂糖珠子，4℃旋轉(zhuǎn)搖床上孵育2 h，4℃、3000 r/min離心3 min，棄上清，沉淀用NP40洗脫液清洗3次，得到的沉淀和之前取出的1/10上清分別加入50μL含巰基乙醇的4×SDS緩沖液，沸水中煮10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，進(jìn)行免疫印跡分析。

1.4 免疫印跡

用細(xì)胞刮子刮取細(xì)胞，4℃、3000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，再用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞3次，用1×PBS重懸細(xì)胞，再加入含巰基乙醇的4×SDS緩沖液混勻，沸水煮10 min后12 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE，半干轉(zhuǎn)膜儀18 V、100 min將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，封閉完畢后孵育一抗（室溫1 h），TBST洗滌3次，每次5 min，孵育二抗（室溫1 h），TBST洗滌3次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光顯影。

1.5 LDH檢測

用碧云天生物公司的乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒檢測細(xì)胞釋放的LDH。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測量資料的方差分析，組間數(shù)據(jù)比較采用Dunnettt檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRAF6與NLRP3相互作用

為了研究TRAF6與NLRP3是否存在相互作用，我們將Myc-TRAF6分別與Flag-Vector和Flag-NLRP3共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，用Flag珠子進(jìn)行免疫共沉淀，結(jié)果顯示Flag-NLRP3的免疫沉淀復(fù)合物中含有Myc-TRAF6，而Flag-Vector的免疫沉淀復(fù)合物中不含Myc-TRAF6（圖1A）。為了進(jìn)一步驗證TRAF6與NLRP3的相互作用，排除Myc-TRAF6與Flag珠子發(fā)生非特異結(jié)合的可能性，再次將Flag-NLRP3分別與Myc-Vector和Myc-TRAF6共 轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，用Myc珠子 進(jìn)行免疫共沉淀，結(jié)果顯示Myc-TRAF6的免疫沉淀復(fù)合物中含有Flag-NLRP3，而Myc-Vector的免疫沉淀復(fù)合物中不含F(xiàn)lag-NLRP3（圖1B）。上述結(jié)果說明TRAF6能夠與NLRP3相互作用。

2.2 TRAF6增加NLRP3的蛋白穩(wěn)定性

TRAF6能夠與NLRP3相互作用，接下來我們研究TRAF6對NLRP3蛋白穩(wěn)定性的影響。將不同劑量的Myc-TRAF6分別與Flag-NLRP3共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，進(jìn)行免疫印跡檢測，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染不同量Myc-TRAF6的實驗組中Myc-TRAF6的表達(dá)量確實存在差異，而且表達(dá)量隨著轉(zhuǎn)染量的增加而增加，證明本實驗使用的轉(zhuǎn)染體系的高效性。同時，Myc-TRAF6能夠使Flag-NLRP3蛋白水平顯著增加（圖2），而且Flag-NLRP3的蛋白水平隨Myc-TRAF6蛋白水平的升高而逐步升高，這說明TRAF6對NLRP3具有正調(diào)控作用。

2.3 TRAF6促進(jìn)NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的LDH釋放

如上，TRAF6能夠與NLRP3相互作用并上調(diào)NLRP3的蛋白穩(wěn)定性，因此進(jìn)一步研究TRAF6對NLRP3炎癥小體信號通路的影響。首先檢測TRAF6小干擾RNA（siRNA）序列在THP-1細(xì)胞中的干擾效率。將TRAF6 siRNA序列和作為對照的siScramble序列分別轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，收取細(xì)胞進(jìn)行免疫印跡實驗，檢測TRAF6的表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染TRAF6 siRNA序列的實驗組THP-1細(xì)胞中TRAF6蛋白表達(dá)水平明顯低于轉(zhuǎn)染siScram?ble序列的對照組（圖3A），說明該TRAF6 siRNA序列可有效敲低THP-1細(xì)胞中的TRAF6。隨后進(jìn)行NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的LDH釋放的研究。先將TRAF6 siRNA序列和siScramble序列分別轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，然后同時加入刺激物L(fēng)PS，接著再同時加入刺激物ATP，刺激一段時間后檢測LDH的釋放。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染TRAF6 siRNA序列的實驗組THP-1細(xì)胞中LDH的釋放量明顯低于轉(zhuǎn)染siScramble序列的對照組（圖3B），說明TRAF6能夠促進(jìn)NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的LDH釋放，能夠正調(diào)控NLRP3炎癥小體信號通路的活性。

圖1 TRAF6與NLRP3相互作用

3 討論

炎癥小體主要由受體蛋白、含CARD結(jié)構(gòu)域的ASC和caspase-1前體（pro-caspase-1）構(gòu)成[10]。不同的受體蛋白響應(yīng)不同的刺激信號，從而介導(dǎo)炎癥小體的組裝，進(jìn)而激活下游信號通路。

NLRP3炎癥小體可以被機(jī)體內(nèi)多種PAMP和DAMP所活化。研究表明，細(xì)胞內(nèi)鉀離子和鈣離子濃度的變化、線粒體損傷后釋放的線粒體DNA和活性氧（reactive oxy gen species，ROS）、顆粒物微晶尿酸鈉（monosodium urate，MSU）等都能夠激活NLRP3炎癥小體[11-15]，翻譯后修飾（post-transla?tional modification，PTM）在NLRP3炎癥小體信號通路的調(diào)控中也起重要作用。

圖2 TRAF6下調(diào)NLRP3的蛋白穩(wěn)定性

圖3 TRAF6抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的LDH釋放

研究表明，有絲分裂相關(guān)的絲蘇氨酸激酶Nek7能夠調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的活化，抑制Nek7的表達(dá)可以阻斷NLRP3炎癥小體的組裝和活化[16-17]。盡管鑒定Nek7在炎癥小體活化中的作用是該領(lǐng)域近年來的重要進(jìn)展之一，但Nek7調(diào)控NLRP3炎癥小體活化的具體機(jī)制還須進(jìn)一步探究。激酶JNK1也能促進(jìn)NLRP3磷酸化，該磷酸化修飾介導(dǎo)了NLRP3去泛素化及寡聚化，進(jìn)而促進(jìn)NLRP3炎癥小體的激活[18-20]。NLRP3炎癥小體的活性除了受到激酶的調(diào)控，文獻(xiàn)報道磷酸酶2A（phosphatase 2A，PP2A）可通過使NLRP3 PYD（pyrin domain，PYD）結(jié)構(gòu)域去磷酸化而調(diào)節(jié)炎癥小體的組裝，可見激酶和磷酸酶之間的平衡對于NLRP3的活化是重要的調(diào)節(jié)元件。除了磷酸化修飾參與的調(diào)控，泛素化修飾也在其中起著重要的作用，有文獻(xiàn)報道，NLRP3炎癥小體活化時依賴其自身的去泛素化，抑制去泛素化酶BRCC3的表達(dá)能夠顯著抑制NLRP3炎癥小體的活化[21]。

盡管近年來關(guān)于NLRP3炎癥小體活化機(jī)制的研究取得了一些重要的進(jìn)展，但仍然還有很多問題很不清楚。比如，目前已知的NLRP3炎癥小體激活劑是如何最終激活NLRP3的，還有哪些成分能夠激活NLRP3炎癥小體，調(diào)控NLRP3炎癥小體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的成分有哪些、它們是如何起作用的等。本研究揭示了TRAF6通過增加NLRP3的穩(wěn)定性正調(diào)控NLRP3炎癥小體信號通路的分子機(jī)制，這不僅闡明了重要信號分子TRAF6的新功能，而且為理解NLRP3炎癥小體激活的分子機(jī)制提供了重要的啟示。但是TRAF6調(diào)控NLRP3炎癥小體信號通路的具體分子機(jī)制是什么，TRAF6是否依賴于其自身E3泛素蛋白連接酶活性泛素化修飾NLRP3促進(jìn)其穩(wěn)定性增加，TRAF6是否特異性地調(diào)控NLRP3炎癥小體信號通路，TRAF6是否特異性地調(diào)控某些成分激活的NLRP3炎癥小體信號通路，這些都還有待進(jìn)一步研究。