鄭霖波，白 冬，虞 舟，張海玲，謝 超,*

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022；2.舟山昌國(guó)食品有限公司，浙江 舟山 316021；3.舟山富晟食品科技有限公司，浙江 舟山 316025）

鰹魚(yú)（Katsuwonus pelamis），俗稱(chēng)炸彈魚(yú)，屬于金槍魚(yú)科（Thunnidae），其產(chǎn)量占金槍魚(yú)漁業(yè)的40%之多[1-3]。鰹魚(yú)蛋白質(zhì)含量高，氨基酸比例合理，且種類(lèi)豐富；膽固醇和脂肪含量低，而且二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）等多不飽和脂肪酸、ω-3多不飽和脂肪酸和礦物質(zhì)元素含量豐富，氨基酸配比合理，符合現(xiàn)代人群健康飲食消費(fèi)觀念，是很好的蛋白質(zhì)來(lái)源食品及便于人體吸收利用的健康食品[4-6]。高頤雄[7]研究了舟山海域的31 種海魚(yú)中脂肪酸含量，發(fā)現(xiàn)扁舵鰹的總脂肪高達(dá)13.2%，且ω-3多不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為2.62%。也有研究報(bào)道，金槍魚(yú)和鰹魚(yú)等大型洄游性魚(yú)的內(nèi)臟和眼窩中含有30%～40% DHA以及5%～10% EPA[8-9]。周敏等[10]測(cè)定了黃鰭金槍魚(yú)眼窩油中DHA含量為19.6 mg/g，占總脂肪質(zhì)量的27.1%，比例較高，適用于DHA相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。

衰老又稱(chēng)老化，是各生物必然經(jīng)歷的一種過(guò)程，是生物在正常狀況下發(fā)育成熟之后，機(jī)體各組織器官功能隨時(shí)間的流逝而減退，自身應(yīng)急免疫能力下降，內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生不穩(wěn)定因素，各結(jié)構(gòu)組分發(fā)生不可抗拒的退行變化現(xiàn)象[11-13]。衰老不可逆轉(zhuǎn)，但是可以進(jìn)行干預(yù)以延緩衰老[14-15]，保持機(jī)體具有足夠的抗氧化物質(zhì)，增加抗氧化酶活力，及時(shí)清除機(jī)體內(nèi)過(guò)量的自由基，減緩其對(duì)細(xì)胞和組織的破壞，從而維持細(xì)胞和組織的正常功能，達(dá)到保持機(jī)體健康和抗衰老的目的[16-17]。深海魚(yú)油中富含DHA和EPA等多不飽和脂肪酸，對(duì)人體正常發(fā)育和保持健康有重要意義，還可預(yù)防和治療多種疾病[18-19]，幼兒及青少年及時(shí)補(bǔ)充DHA和EPA，可促進(jìn)其視力以及智力的發(fā)育，中老年人及時(shí)補(bǔ)充可預(yù)防延緩由衰老所帶來(lái)的一系列疾病，如心腦血管疾病、高血壓、高血脂、視力下降、阿爾茨海默病等癥狀[20-22]。

目前鰹魚(yú)肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的分析和評(píng)價(jià)與保鮮維持品質(zhì)的研究報(bào)道較多，鮮有有關(guān)鰹魚(yú)魚(yú)油生物活性功能的評(píng)價(jià)，本實(shí)驗(yàn)探討深海鰹魚(yú)魚(yú)油對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老小鼠抗衰老功能的影響，以期為鰹魚(yú)油抗氧化、抗衰老能力提供新的理論數(shù)據(jù)，也為鰹魚(yú)的綜合開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

雄性ICR小鼠，平均體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)站，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。

鰹魚(yú)魚(yú)油由實(shí)驗(yàn)室提取、精制（DHA、EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)45%，高于一般市售魚(yú)油）；金槍魚(yú)油（主要原料為金槍魚(yú)油、VE、檸檬酸，其中DHA、EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)29.6%） 上海恒壽堂藥業(yè)有限公司。

D-半乳糖、冰醋酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

BT125D型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；16K-M高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙鑫奧儀器儀表有限公司；酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分組

將小鼠（（20±2）g）在清潔安靜、溫度適宜的動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：（25±2）℃下每12 h晝夜交替照明。3 d后取出，隨機(jī)分成6 組，每組8 只，即空白對(duì)照組（BC）；鰹魚(yú)魚(yú)油組：低劑量組（LD）、中劑量組（MD）、高劑量組（HD）；D-半乳糖模型組（NC）；陽(yáng)性對(duì)照組（PC）。

1.3.2 小鼠給藥

采用皮下注射方式，給鰹魚(yú)魚(yú)油組、陽(yáng)性對(duì)照組和D-半乳糖模型組每只小鼠每天注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的D-半乳糖（1 000 mg/kg mb），空白組小鼠每只每天注射等體積0.9%的生理鹽水，連續(xù)注射6 周。注射4% D-半乳糖的同時(shí)，鰹魚(yú)魚(yú)油組分別每天灌胃10 mL/kg mb不同質(zhì)量濃度的魚(yú)油（低、中、高劑量組分別為20、50、100 mg/mL），陽(yáng)性對(duì)照組灌胃市售魚(yú)油（100 mg/kg mb），空白對(duì)照組和D-半乳糖模型組灌胃等體積生理鹽水[23]。

1.3.3 小鼠灌胃

用左手抓緊小鼠背部和頭部的皮毛，使其固定，并使其頭部后仰，與身體成一水平直線(xiàn)，將針頭自口腔右側(cè)沿上顎垂直緩慢下行，灌藥，觀察小鼠呼吸是否正常[24]。

1.3.4 組織處理及準(zhǔn)備

血清準(zhǔn)備：采血前12 h 禁食，采血1 h前禁水，選用眼球摘除采血法采血，立即4 000 r/min離心15 min取血清，-80 ℃保存[25]。

肝組織處理：脫頸處死小鼠后，剪開(kāi)腹腔完整取出小鼠肝臟后用4 ℃生理鹽水清洗，濾紙吸干，保存在Bouin氏固定液中，制作石蠟切片并進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察肝臟組織病理變化情況。

肝勻漿制備：脫頸處死小鼠后，剪開(kāi)腹腔完整取出小鼠肝臟加入4 ℃預(yù)冷生理鹽水制成10%的肝臟組織勻漿，低溫離心機(jī)4 ℃、3 000 r/min離心10～15 min，取上清液，加入生理鹽水配制成實(shí)驗(yàn)所需的各濃度，4 ℃保存待測(cè)。

1.3.5 肝脾指數(shù)的計(jì)算

根據(jù)公式（1）、（2）分別計(jì)算肝指數(shù)和脾指數(shù)。

1.3.6 生化指標(biāo)的測(cè)定

測(cè)定GSH-Px、T-SOD、CAT活力以及MDA含量等指標(biāo)，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.7 肝臟切片及HE染色

小鼠肝臟組織于Bouin氏固定液中固定24 h，取出修整，梯度乙醇脫水后常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切3 μm厚切片、染色、脫水后封片，然后在光學(xué)電子顯微鏡下觀察肝組織病理變化情況[26-27]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理及作圖采用Origin 8.1、SPSS 13.0軟件，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用SNK法分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠肝指數(shù)和脾指數(shù)

圖 1 各組小鼠的肝指數(shù)Fig. 1 Liver index of mice in different groups

圖 2 各組小鼠的脾指數(shù)Fig. 2 Thymus index of mice in different groups

由圖1所示，與模型組相比，鰹魚(yú)魚(yú)油中、高劑量組和空白對(duì)照組的肝指數(shù)呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05），低劑量組肝指數(shù)表現(xiàn)出一定的下降趨勢(shì)（P＞0.05）。由圖2可知，鰹魚(yú)魚(yú)油高劑量組、空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組與模型組相比脾指數(shù)顯著下降（P＜0.05），低、中劑量組表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，但差異并不顯著。結(jié)果表明鰹魚(yú)魚(yú)油可在一定程度上降低小鼠肝、脾指數(shù)。

2.2 小鼠肝臟生化指標(biāo)

表 1 鰹魚(yú)魚(yú)油對(duì)衰老小鼠肝勻漿中GSH-Px、T-SOD、CAT活力和MDA含量的影響（n＝8）Table 1 Effect of skipjack tuna oil on GSH-Px, T-SOD and CAT activity and MDA content in liver homogenate of aging mice (n= 8)

大量實(shí)驗(yàn)證明，小鼠經(jīng)D-半乳糖注射誘導(dǎo)可以導(dǎo)致其加速衰老，并且有類(lèi)似于自然衰老的各種生理生化的老化表現(xiàn)[28-29]。由表1可知，與空白對(duì)照組相比，D-半乳糖模型組中GSH-Px、T-SOD、CAT活力均極顯著降低（P＜0.01），MDA含量極顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明D-半乳糖致衰老型小鼠造模成功。與D-半乳糖模型組相比，鰹魚(yú)魚(yú)油各劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組均顯著提升了肝勻漿GSH-Px、T-SOD、CAT活力（P＜0.05），且各指標(biāo)隨鰹魚(yú)魚(yú)油劑量的增加而升高，均降低了MDA含量。說(shuō)明鰹魚(yú)魚(yú)油能夠提高肝組織GSH-Px、T-SOD、CAT活力，降低MDA含量，有緩解衰老的效果，且高劑量組的作用最為明顯。這表示鰹魚(yú)魚(yú)油中不飽和脂肪酸有可能替代了機(jī)體內(nèi)的還原物質(zhì)，使其免受氧化而維持了正常的生理功能。

2.3 小鼠血液生化指標(biāo)

表 2 鰹魚(yú)魚(yú)油對(duì)衰老小鼠血清中GSH-Px、T-SOD、CAT活力和MDA濃度的影響（n＝8）Table 2 Effect of skipjack tuna oil on GSH-Px, T-SOD and CAT activity and MDA concentration in serum of aging mice (n= 8)

由表2可知，D-半乳糖模型組與空白對(duì)照組相比，血清中GSH-Px、T-SOD活力極顯著下降（P＜0.01），CAT活力顯著下降（P＜0.05），MDA濃度極顯著上升（P＜0.01），再次驗(yàn)證造模成功。與D-半乳糖模型組相比，高劑量組可極顯著提升GSH-Px、T-SOD、CAT活力（P＜0.01）并降低MDA濃度（P＜0.01）；中劑量組能極顯著提高GSH-Px活力（P＜0.01），極顯著降低MDA濃度（P＜0.01）；陽(yáng)性對(duì)照組能夠極顯著提升GSH-Px活力（P＜0.01），T-SOD和CAT活力升高顯著（P＜0.05），MDA濃度極顯著下降（P＜0.01）。說(shuō)明鰹魚(yú)魚(yú)油中、高劑量組緩解衰老的效果與市售魚(yú)油的效果相似，均可提升GSH-Px、T-SOD、CAT活力，且使細(xì)胞中MDA濃度下降到正常水平從而達(dá)到延緩衰老的作用。

2.4 小鼠肝臟組織切片觀察分析

圖 3 小鼠各組肝組織切片HE染色結(jié)果（100×）Fig. 3 Hematoxylin and eosin staining of liver tissue of mice in all groups (100 ×)

如圖3所示，空白對(duì)照組小鼠中央靜脈結(jié)構(gòu)正常，呈較為規(guī)則的圓形，肝竇正常，肝索排列規(guī)范無(wú)異常，肝小葉和肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；D-半乳糖模型組與空白對(duì)照組相比，肝索排列雜亂無(wú)序，肝竇擴(kuò)張明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)異常，肝細(xì)胞體積縮小，部分細(xì)胞可見(jiàn)雙核；陽(yáng)性對(duì)照組肝細(xì)胞體積較D-半乳糖模型組增大，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊規(guī)范，肝竇無(wú)明顯擴(kuò)張；高劑量組肝細(xì)胞大小與結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常，肝小葉結(jié)構(gòu)無(wú)異常，肝竇無(wú)擴(kuò)張，肝索排列結(jié)構(gòu)正常；中劑量組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，排列規(guī)范，肝竇未見(jiàn)明顯擴(kuò)張，肝小葉與肝索結(jié)構(gòu)無(wú)異常；低劑量組部分肝細(xì)胞體積增大，出現(xiàn)雙核細(xì)胞，肝索及肝竇結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常[30-32]。

由此可見(jiàn)，鰹魚(yú)魚(yú)油可減緩細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的破壞，保護(hù)細(xì)胞以及組織功能正常，延緩衰老的進(jìn)程。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，皮下注射D-半乳糖小鼠連續(xù)攝入鰹魚(yú)魚(yú)油6 周后，小鼠體內(nèi)抗氧化酶（GSH-Px、T-SOD及CAT）活力顯著升高，MDA濃度明顯下降，與D-半乳糖模型組相比差異有顯著性，且效果與鰹魚(yú)魚(yú)油攝入含量成正比。鰹魚(yú)魚(yú)油含有豐富的不飽和脂肪酸，特別是DHA和EPA，因此含有豐富的不飽和鍵，其可代替生物機(jī)體完成正常代謝過(guò)程中的氧化環(huán)節(jié)，有效地清除過(guò)量自由基，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，增強(qiáng)抗氧化酶活力進(jìn)一步提升清除自由基的能力。同時(shí)，觀察肝臟切片HE染色結(jié)果可知，相比于D-半乳糖模型組，鰹魚(yú)魚(yú)油制劑組肝細(xì)胞大小與結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常，肝小葉結(jié)構(gòu)無(wú)異常，肝竇無(wú)擴(kuò)張，肝索排列結(jié)構(gòu)正常，高劑量組與空白對(duì)照組染色結(jié)果相似，效果較佳。