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        深海鰹魚(yú)魚(yú)油對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠抗衰老的作用

        2019-04-02 03:42:56鄭霖波張海玲
        食品科學(xué) 2019年5期
        關(guān)鍵詞:魚(yú)油半乳糖空白對(duì)照

        鄭霖波,白 冬,虞 舟,張海玲,謝 超,*

        (1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院,浙江 舟山 316022;2.舟山昌國(guó)食品有限公司,浙江 舟山 316021;3.舟山富晟食品科技有限公司,浙江 舟山 316025)

        鰹魚(yú)(Katsuwonus pelamis),俗稱(chēng)炸彈魚(yú),屬于金槍魚(yú)科(Thunnidae),其產(chǎn)量占金槍魚(yú)漁業(yè)的40%之多[1-3]。鰹魚(yú)蛋白質(zhì)含量高,氨基酸比例合理,且種類(lèi)豐富;膽固醇和脂肪含量低,而且二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)等多不飽和脂肪酸、ω-3多不飽和脂肪酸和礦物質(zhì)元素含量豐富,氨基酸配比合理,符合現(xiàn)代人群健康飲食消費(fèi)觀念,是很好的蛋白質(zhì)來(lái)源食品及便于人體吸收利用的健康食品[4-6]。高頤雄[7]研究了舟山海域的31 種海魚(yú)中脂肪酸含量,發(fā)現(xiàn)扁舵鰹的總脂肪高達(dá)13.2%,且ω-3多不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,為2.62%。也有研究報(bào)道,金槍魚(yú)和鰹魚(yú)等大型洄游性魚(yú)的內(nèi)臟和眼窩中含有30%~40% DHA以及5%~10% EPA[8-9]。周敏等[10]測(cè)定了黃鰭金槍魚(yú)眼窩油中DHA含量為19.6 mg/g,占總脂肪質(zhì)量的27.1%,比例較高,適用于DHA相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。

        衰老又稱(chēng)老化,是各生物必然經(jīng)歷的一種過(guò)程,是生物在正常狀況下發(fā)育成熟之后,機(jī)體各組織器官功能隨時(shí)間的流逝而減退,自身應(yīng)急免疫能力下降,內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生不穩(wěn)定因素,各結(jié)構(gòu)組分發(fā)生不可抗拒的退行變化現(xiàn)象[11-13]。衰老不可逆轉(zhuǎn),但是可以進(jìn)行干預(yù)以延緩衰老[14-15],保持機(jī)體具有足夠的抗氧化物質(zhì),增加抗氧化酶活力,及時(shí)清除機(jī)體內(nèi)過(guò)量的自由基,減緩其對(duì)細(xì)胞和組織的破壞,從而維持細(xì)胞和組織的正常功能,達(dá)到保持機(jī)體健康和抗衰老的目的[16-17]。深海魚(yú)油中富含DHA和EPA等多不飽和脂肪酸,對(duì)人體正常發(fā)育和保持健康有重要意義,還可預(yù)防和治療多種疾病[18-19],幼兒及青少年及時(shí)補(bǔ)充DHA和EPA,可促進(jìn)其視力以及智力的發(fā)育,中老年人及時(shí)補(bǔ)充可預(yù)防延緩由衰老所帶來(lái)的一系列疾病,如心腦血管疾病、高血壓、高血脂、視力下降、阿爾茨海默病等癥狀[20-22]。

        目前鰹魚(yú)肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的分析和評(píng)價(jià)與保鮮維持品質(zhì)的研究報(bào)道較多,鮮有有關(guān)鰹魚(yú)魚(yú)油生物活性功能的評(píng)價(jià),本實(shí)驗(yàn)探討深海鰹魚(yú)魚(yú)油對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老小鼠抗衰老功能的影響,以期為鰹魚(yú)油抗氧化、抗衰老能力提供新的理論數(shù)據(jù),也為鰹魚(yú)的綜合開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 動(dòng)物、材料與試劑

        雄性ICR小鼠,平均體質(zhì)量18~22 g,購(gòu)于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)站,許可證號(hào):SCXK(滬)2017-0005。

        鰹魚(yú)魚(yú)油由實(shí)驗(yàn)室提取、精制(DHA、EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)45%,高于一般市售魚(yú)油);金槍魚(yú)油(主要原料為金槍魚(yú)油、VE、檸檬酸,其中DHA、EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)29.6%) 上海恒壽堂藥業(yè)有限公司。

        D-半乳糖、冰醋酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

        1.2 儀器與設(shè)備

        BT125D型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;16K-M高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙鑫奧儀器儀表有限公司;酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher公司。

        1.3 方法

        1.3.1 小鼠分組

        將小鼠((20±2)g)在清潔安靜、溫度適宜的動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件:(25±2)℃下每12 h晝夜交替照明。3 d后取出,隨機(jī)分成6 組,每組8 只,即空白對(duì)照組(BC);鰹魚(yú)魚(yú)油組:低劑量組(LD)、中劑量組(MD)、高劑量組(HD);D-半乳糖模型組(NC);陽(yáng)性對(duì)照組(PC)。

        1.3.2 小鼠給藥

        采用皮下注射方式,給鰹魚(yú)魚(yú)油組、陽(yáng)性對(duì)照組和D-半乳糖模型組每只小鼠每天注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的D-半乳糖(1 000 mg/kg mb),空白組小鼠每只每天注射等體積0.9%的生理鹽水,連續(xù)注射6 周。注射4% D-半乳糖的同時(shí),鰹魚(yú)魚(yú)油組分別每天灌胃10 mL/kg mb不同質(zhì)量濃度的魚(yú)油(低、中、高劑量組分別為20、50、100 mg/mL),陽(yáng)性對(duì)照組灌胃市售魚(yú)油(100 mg/kg mb),空白對(duì)照組和D-半乳糖模型組灌胃等體積生理鹽水[23]。

        1.3.3 小鼠灌胃

        用左手抓緊小鼠背部和頭部的皮毛,使其固定,并使其頭部后仰,與身體成一水平直線(xiàn),將針頭自口腔右側(cè)沿上顎垂直緩慢下行,灌藥,觀察小鼠呼吸是否正常[24]。

        1.3.4 組織處理及準(zhǔn)備

        血清準(zhǔn)備:采血前12 h 禁食,采血1 h前禁水,選用眼球摘除采血法采血,立即4 000 r/min離心15 min取血清,-80 ℃保存[25]。

        肝組織處理:脫頸處死小鼠后,剪開(kāi)腹腔完整取出小鼠肝臟后用4 ℃生理鹽水清洗,濾紙吸干,保存在Bouin氏固定液中,制作石蠟切片并進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察肝臟組織病理變化情況。

        肝勻漿制備:脫頸處死小鼠后,剪開(kāi)腹腔完整取出小鼠肝臟加入4 ℃預(yù)冷生理鹽水制成10%的肝臟組織勻漿,低溫離心機(jī)4 ℃、3 000 r/min離心10~15 min,取上清液,加入生理鹽水配制成實(shí)驗(yàn)所需的各濃度,4 ℃保存待測(cè)。

        1.3.5 肝脾指數(shù)的計(jì)算

        根據(jù)公式(1)、(2)分別計(jì)算肝指數(shù)和脾指數(shù)。

        1.3.6 生化指標(biāo)的測(cè)定

        測(cè)定GSH-Px、T-SOD、CAT活力以及MDA含量等指標(biāo),具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

        1.3.7 肝臟切片及HE染色

        小鼠肝臟組織于Bouin氏固定液中固定24 h,取出修整,梯度乙醇脫水后常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切3 μm厚切片、染色、脫水后封片,然后在光學(xué)電子顯微鏡下觀察肝組織病理變化情況[26-27]。

        1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

        數(shù)據(jù)處理及作圖采用Origin 8.1、SPSS 13.0軟件,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,采用SNK法分析差異顯著性。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 小鼠肝指數(shù)和脾指數(shù)

        圖 1 各組小鼠的肝指數(shù)Fig. 1 Liver index of mice in different groups

        圖 2 各組小鼠的脾指數(shù)Fig. 2 Thymus index of mice in different groups

        由圖1所示,與模型組相比,鰹魚(yú)魚(yú)油中、高劑量組和空白對(duì)照組的肝指數(shù)呈顯著下降趨勢(shì)(P<0.05),低劑量組肝指數(shù)表現(xiàn)出一定的下降趨勢(shì)(P>0.05)。由圖2可知,鰹魚(yú)魚(yú)油高劑量組、空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組與模型組相比脾指數(shù)顯著下降(P<0.05),低、中劑量組表現(xiàn)出下降趨勢(shì),但差異并不顯著。結(jié)果表明鰹魚(yú)魚(yú)油可在一定程度上降低小鼠肝、脾指數(shù)。

        2.2 小鼠肝臟生化指標(biāo)

        表 1 鰹魚(yú)魚(yú)油對(duì)衰老小鼠肝勻漿中GSH-Px、T-SOD、CAT活力和MDA含量的影響(n=8)Table 1 Effect of skipjack tuna oil on GSH-Px, T-SOD and CAT activity and MDA content in liver homogenate of aging mice (n= 8)

        大量實(shí)驗(yàn)證明,小鼠經(jīng)D-半乳糖注射誘導(dǎo)可以導(dǎo)致其加速衰老,并且有類(lèi)似于自然衰老的各種生理生化的老化表現(xiàn)[28-29]。由表1可知,與空白對(duì)照組相比,D-半乳糖模型組中GSH-Px、T-SOD、CAT活力均極顯著降低(P<0.01),MDA含量極顯著升高(P<0.01),說(shuō)明D-半乳糖致衰老型小鼠造模成功。與D-半乳糖模型組相比,鰹魚(yú)魚(yú)油各劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組均顯著提升了肝勻漿GSH-Px、T-SOD、CAT活力(P<0.05),且各指標(biāo)隨鰹魚(yú)魚(yú)油劑量的增加而升高,均降低了MDA含量。說(shuō)明鰹魚(yú)魚(yú)油能夠提高肝組織GSH-Px、T-SOD、CAT活力,降低MDA含量,有緩解衰老的效果,且高劑量組的作用最為明顯。這表示鰹魚(yú)魚(yú)油中不飽和脂肪酸有可能替代了機(jī)體內(nèi)的還原物質(zhì),使其免受氧化而維持了正常的生理功能。

        2.3 小鼠血液生化指標(biāo)

        表 2 鰹魚(yú)魚(yú)油對(duì)衰老小鼠血清中GSH-Px、T-SOD、CAT活力和MDA濃度的影響(n=8)Table 2 Effect of skipjack tuna oil on GSH-Px, T-SOD and CAT activity and MDA concentration in serum of aging mice (n= 8)

        由表2可知,D-半乳糖模型組與空白對(duì)照組相比,血清中GSH-Px、T-SOD活力極顯著下降(P<0.01),CAT活力顯著下降(P<0.05),MDA濃度極顯著上升(P<0.01),再次驗(yàn)證造模成功。與D-半乳糖模型組相比,高劑量組可極顯著提升GSH-Px、T-SOD、CAT活力(P<0.01)并降低MDA濃度(P<0.01);中劑量組能極顯著提高GSH-Px活力(P<0.01),極顯著降低MDA濃度(P<0.01);陽(yáng)性對(duì)照組能夠極顯著提升GSH-Px活力(P<0.01),T-SOD和CAT活力升高顯著(P<0.05),MDA濃度極顯著下降(P<0.01)。說(shuō)明鰹魚(yú)魚(yú)油中、高劑量組緩解衰老的效果與市售魚(yú)油的效果相似,均可提升GSH-Px、T-SOD、CAT活力,且使細(xì)胞中MDA濃度下降到正常水平從而達(dá)到延緩衰老的作用。

        2.4 小鼠肝臟組織切片觀察分析

        圖 3 小鼠各組肝組織切片HE染色結(jié)果(100×)Fig. 3 Hematoxylin and eosin staining of liver tissue of mice in all groups (100 ×)

        如圖3所示,空白對(duì)照組小鼠中央靜脈結(jié)構(gòu)正常,呈較為規(guī)則的圓形,肝竇正常,肝索排列規(guī)范無(wú)異常,肝小葉和肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常;D-半乳糖模型組與空白對(duì)照組相比,肝索排列雜亂無(wú)序,肝竇擴(kuò)張明顯,肝小葉結(jié)構(gòu)異常,肝細(xì)胞體積縮小,部分細(xì)胞可見(jiàn)雙核;陽(yáng)性對(duì)照組肝細(xì)胞體積較D-半乳糖模型組增大,肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝索排列整齊規(guī)范,肝竇無(wú)明顯擴(kuò)張;高劑量組肝細(xì)胞大小與結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常,肝小葉結(jié)構(gòu)無(wú)異常,肝竇無(wú)擴(kuò)張,肝索排列結(jié)構(gòu)正常;中劑量組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,排列規(guī)范,肝竇未見(jiàn)明顯擴(kuò)張,肝小葉與肝索結(jié)構(gòu)無(wú)異常;低劑量組部分肝細(xì)胞體積增大,出現(xiàn)雙核細(xì)胞,肝索及肝竇結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常[30-32]。

        由此可見(jiàn),鰹魚(yú)魚(yú)油可減緩細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的破壞,保護(hù)細(xì)胞以及組織功能正常,延緩衰老的進(jìn)程。

        3 結(jié) 論

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,皮下注射D-半乳糖小鼠連續(xù)攝入鰹魚(yú)魚(yú)油6 周后,小鼠體內(nèi)抗氧化酶(GSH-Px、T-SOD及CAT)活力顯著升高,MDA濃度明顯下降,與D-半乳糖模型組相比差異有顯著性,且效果與鰹魚(yú)魚(yú)油攝入含量成正比。鰹魚(yú)魚(yú)油含有豐富的不飽和脂肪酸,特別是DHA和EPA,因此含有豐富的不飽和鍵,其可代替生物機(jī)體完成正常代謝過(guò)程中的氧化環(huán)節(jié),有效地清除過(guò)量自由基,減少脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生,增強(qiáng)抗氧化酶活力進(jìn)一步提升清除自由基的能力。同時(shí),觀察肝臟切片HE染色結(jié)果可知,相比于D-半乳糖模型組,鰹魚(yú)魚(yú)油制劑組肝細(xì)胞大小與結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常,肝小葉結(jié)構(gòu)無(wú)異常,肝竇無(wú)擴(kuò)張,肝索排列結(jié)構(gòu)正常,高劑量組與空白對(duì)照組染色結(jié)果相似,效果較佳。

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