邱濤濤，徐振林，甘慶慶，王蘭騰，沈 興，李向梅，孫遠(yuǎn)明，雷紅濤*

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

在食物和飼料中針對(duì)性地添加營(yíng)養(yǎng)成分物質(zhì)是降低毒素誘發(fā)危害的有效措施之一。卵黃免疫球蛋白（egg yolk immunogolbulin，IgY）又稱卵黃抗體，是從特定抗原免疫禽類蛋黃中提取的抗體，與哺乳動(dòng)物血清免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）具有相同特性，能與抗原特異性識(shí)別結(jié)合，但又不同于IgG，IgY不與細(xì)菌或哺乳動(dòng)物的受體Fc結(jié)合，且不激活補(bǔ)體系統(tǒng)[1]。IgY來(lái)源方便、無(wú)需采血且無(wú)損傷，符合動(dòng)物福利原則，具備成本低、易貯藏、易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)勢(shì)[2-3]；所以歐洲替代方法驗(yàn)證中心建議以IgY代替哺乳動(dòng)物IgG作為生產(chǎn)抗體的來(lái)源。如今，IgY以其具有的生物學(xué)特點(diǎn)和應(yīng)用方面的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)應(yīng)用于嬰幼兒食品和牲畜飼料中，用于抵抗病毒和細(xì)菌性疾病的侵害[4]。另對(duì)IgY的研究發(fā)現(xiàn)，其還可以有效識(shí)別大分子蛋白毒素如蛇毒、細(xì)菌外毒素等，起到中和毒素、降低毒性的作用[5-6]。本文就IgY體內(nèi)代謝和中和毒素的研究近況做簡(jiǎn)要闡述，以期為脫除食品和飼料中毒素提供新的思路。

1 IgY的形成和結(jié)構(gòu)

禽類通過(guò)法氏囊控制體液免疫系統(tǒng)，當(dāng)受到外界特異性抗原（尤其是滅活抗原）的刺激后，經(jīng)體液免疫，在法氏囊內(nèi)激活B細(xì)胞，激活的B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞并分泌特異性抗體進(jìn)入血液循環(huán)。當(dāng)血液流經(jīng)卵巢時(shí)，血液中的特異性抗體（IgG）主要在卵黃中蓄集起來(lái)，形成IgY[7-8]。如圖1A所示，IgY由兩條重鏈（H）和兩條輕鏈（L）組成，分子質(zhì)量約為180 kDa，重鏈分子質(zhì)量為62～67 kDa，輕鏈為22～25 kDa，抗原結(jié)合片段（fragment antigen binding，F(xiàn)ab）部分分子質(zhì)量約為45 kDa。如圖1B所示，完整型IgY的重鏈由一個(gè)可變區(qū)（VH）和4 個(gè)恒定區(qū)（CH1、CH2、CH3、CH4）組成，由于其鉸鏈區(qū)與IgG氨基酸序列不同，鉸鏈區(qū)相對(duì)較短且柔性差；輕鏈由一個(gè)可變區(qū)（VL）和一個(gè)恒定區(qū)（CL）組成；抗體中的Fc片斷是主要的疏水基團(tuán)[9]。IgY和IgG的分子結(jié)構(gòu)見圖1[10]。對(duì)IgG和IgY分子恒定區(qū)氨基酸比對(duì)顯示，IgG分子中Cγ2和Cγ3區(qū)分別與IgY分子中CH3和CH4具有很高的同源性[11]。Helm等[12]發(fā)現(xiàn)IgY的CH1—CH2和CH3—CH4之間有一段脯氨酸和甘氨酸殘基區(qū)域，此區(qū)域能使IgY分子具有一定的可折疊性，并認(rèn)為這個(gè)區(qū)域與IgY的功能形成有關(guān)。

圖 1 IgY（A）和IgG（B）分子結(jié)構(gòu)[10]Fig. 1 Molecular structures of IgY (A) and IgG (B)[10]

2 IgY的提取與純化

綜合經(jīng)濟(jì)性和可操作性考慮，多采用肌肉注射或胸部皮下多次注射兩種急性方式免疫蛋雞，初次免疫后200 d或整個(gè)產(chǎn)蛋期均能獲得有效價(jià)的IgY[1]。目前廣泛適用的IgY提取純化方法往往受限于純化步驟，而卵黃中的脂質(zhì)和脂蛋白對(duì)純化影響最大。IgY的初始提取步驟應(yīng)盡量除去脂質(zhì)和脂蛋白[13]，現(xiàn)有商業(yè)化和實(shí)驗(yàn)中常用去脂方法包括有機(jī)溶劑提取法、鹽析法、有機(jī)溶劑及有機(jī)物沉淀法、層析法、凍融法、膜過(guò)濾法和酸性條件下水稀釋法[14]。提取后再經(jīng)鹽析法、凝膠過(guò)濾層析法、膜過(guò)濾法和離子交換層析法等進(jìn)一步純化[15]。不同的提取和純化方法得到的IgY產(chǎn)量、純度和活性亦不相同，有機(jī)溶劑提取法產(chǎn)率較高，但因上清液中有殘留，對(duì)抗體活性有影響，同時(shí)有機(jī)溶劑造成的環(huán)境污染嚴(yán)重，此方法僅適合實(shí)驗(yàn)室少量制備；鹽析法和沉淀法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，但提取的IgY純度低；層析法能得到高純度的特異性IgY，但因產(chǎn)率低、費(fèi)用高而不能大規(guī)模應(yīng)用，僅適用于科研；凍融法回收率偏低；膜過(guò)濾法成本偏高；水稀釋法具有工藝簡(jiǎn)便、生產(chǎn)成本較低和回收率高等優(yōu)點(diǎn)，比較適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。在實(shí)際制備純化過(guò)程中，應(yīng)優(yōu)化組合各種提取、純化和濃縮方法，使方法盡量經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便，且產(chǎn)率和活性高。

3 IgY體內(nèi)代謝活性研究

3.1 IgY活性影響因素

3.1.1 IgY的酸穩(wěn)定性

IgY等電點(diǎn)在5.7～7.6之間，其在pH 4.0～11.0時(shí)穩(wěn)定。在酸性條件下（pH 3.0～3.5）活性下降，且IgY的活性較其他抗體下降更快。通過(guò)色氨酸自然熒光變化跟蹤酸性環(huán)境對(duì)抗體立體結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)在酸性條件下，IgY比其他抗體更容易產(chǎn)生立體結(jié)構(gòu)變化[16]。

3.1.2 IgY對(duì)酶的敏感性

在胃腸道消化過(guò)程中，IgY能抵抗胃腸道中胰蛋白酶和胰凝乳酶的分解，而胃蛋白酶和糜蛋白酶對(duì)其作用明顯，能特異性降低IgY的活性。pH值在2.0以下時(shí)，IgY在胃蛋白酶作用下易失去活性；在pH 4.0的酸性條件下，胃蛋白酶作用4 h后IgY活力下降50%；而如果僅用胃蛋白酶酶解24 h，酶解片段仍具有抗體活性，保持中和抗原的特性；酸性條件對(duì)胃蛋白酶降低IgY活性影響較大，堿性（重碳酸鈉鹽）和高濃度蛋白質(zhì)溶液能增加IgY抗酸和抗蛋白酶水解能力[17]。

3.1.3 IgY的熱穩(wěn)定性

低溫狀態(tài)下，IgY在4 ℃條件下能夠貯存5 年，室溫下能夠存放6 個(gè)月，抗體活性不會(huì)發(fā)生變化[18]。高溫狀態(tài)下，通常IgY熱穩(wěn)定性的上限是60 ℃，當(dāng)加入其他輔助試劑時(shí)，例如質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的蔗糖、海藻糖或乳糖，其耐熱上限可以達(dá)到70 ℃。用胃蛋白酶酶解制備的活性片段Fab’在溫度為65 ℃條件下加熱15 min，結(jié)合抗原活性未發(fā)生改變；在低pH值和高鹽濃度條件下，F(xiàn)ab’的活性也未受影響，說(shuō)明Fab’的熱、酸堿穩(wěn)定性和對(duì)鹽離子濃度的耐受性均高于IgY[19]。

3.1.4 IgY的沉淀和凝集作用

IgY僅在一定的鹽濃度環(huán)境中產(chǎn)生沉淀反應(yīng)。這可能與IgY的空間構(gòu)象有關(guān)，IgY的兩個(gè)Fab片段太靠近以致難以與兩個(gè)大抗原結(jié)合，當(dāng)在一定的鹽濃度和酸性條件下，兩個(gè)Fab片段得以釋放，出現(xiàn)沉淀反應(yīng)。在鹽的誘導(dǎo)下，由Fc段介導(dǎo)的抗原抗體聚集反應(yīng)原理尚不清楚，推測(cè)IgY的兩個(gè)Fab’片段的CH2區(qū)可能與聚集作用的發(fā)生有關(guān)，另外碳水化合物殘基閉合抗原結(jié)合位點(diǎn)，可導(dǎo)致其失去凝集抗原的能力[20]。

3.2 口服IgY體內(nèi)代謝活性研究

IgY在疾病治療上的作用極大延伸了抗體應(yīng)用范圍。雖然利用口服方式發(fā)揮治療作用的確切機(jī)制尚不清楚，但其根本是基于抗體抗原的相互作用[21]。蛋白質(zhì)或多肽經(jīng)口服以后，往往會(huì)在胃中較低pH值條件下被蛋白酶降解，形成小的片段被腸道吸收或失活。不同的研究發(fā)現(xiàn)嬰兒和成人口服IgG后，其糞便仍然有19%～50%的抗體具有活性[22]。Reilly等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，IgY在腸道中呈現(xiàn)出較其他抗體更強(qiáng)的耐受性，因此其在口服應(yīng)用上具有一定的優(yōu)勢(shì)；且因其高特異性，口服IgY對(duì)細(xì)菌或病毒引起的非消化道和全身性疾病有顯著的控制作用[24]。Yokoyama等[25]用質(zhì)量濃度為100 mg/mL的抗-K88g IgY分別喂食不同日齡幼齡仔豬5 mL，檢測(cè)飼喂后0、2、6、24 h抗-K88g IgY在幼齡仔豬血液和胃腸道中的分布情況，檢測(cè)結(jié)果顯示，幼齡仔豬未成熟的胃腸道環(huán)境不能破壞IgY活性，IgY能被胃腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)至循環(huán)系統(tǒng)，其在血液中的半衰期為1.85 d。成熟機(jī)體攝入IgY后，因IgY不與細(xì)菌或哺乳動(dòng)物的受體Fc結(jié)合，完整IgY不被機(jī)體所吸收[26]。在胃酸性條件下，IgY經(jīng)胃蛋白酶和糜蛋白酶分解，部分失去活性，其余部分以活性片段（如：Fab和Fab’）和完整分子結(jié)構(gòu)形式存在。少量活性片段經(jīng)胃腸道吸收進(jìn)入血液，在血液循環(huán)的帶動(dòng)下到達(dá)病灶處與病原菌結(jié)合，發(fā)揮其免疫學(xué)活性[27]。未被吸收的部分IgY在腸道中可有效抑制細(xì)菌的定植、增殖及分泌毒素，最后排出體外；因此，可以預(yù)期IgY經(jīng)口攝入后，不會(huì)對(duì)人體系統(tǒng)產(chǎn)生危害影響[28]，且能保持部分活性，發(fā)揮其對(duì)特定抗原的抑制作用。為更好增強(qiáng)IgY的口服穩(wěn)定性，延緩IgY的釋放，提高其生物利用度，國(guó)內(nèi)外研究者采用混合添加劑法、多糖修飾法和包埋法等增強(qiáng)IgY對(duì)胃酸和胃蛋白酶的穩(wěn)定性[29-30]。

4 IgY中和大分子蛋白毒素研究

4.1 IgY中和蛇毒研究

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界現(xiàn)有3 000余種蛇類，約650 種毒蛇，而這其中有近300 種毒蛇對(duì)人體有致命危險(xiǎn)[31]。蛇毒是毒蛇的毒腺中分泌的一種天然的含有多種酶類、非酶類的毒性蛋白質(zhì)和多肽類物質(zhì)。毒蛇毒液注入人體后可引起外周神經(jīng)毒、凝血障礙、肌肉毒性和腎功能衰竭；部分成分能誘發(fā)神經(jīng)毒性、心臟毒性和組織壞死毒性而呈現(xiàn)致命性[32]。蛇毒的危害是全世界熱帶和亞熱帶地區(qū)主要公共衛(wèi)生問(wèn)題[33]。現(xiàn)在世界范圍內(nèi)主要通過(guò)注射動(dòng)物源性抗蛇毒血清以中和蛇毒治療蛇傷，其策略就是用抗體抗原結(jié)合中和蛇毒。抗體能與毒素形成復(fù)合物，改變活性蛇毒分子生物利用度，或利用抗體和抗原的結(jié)合干預(yù)毒素與受體的相互作用，達(dá)到抑制毒素毒性的作用[34]。1990年Thalley等[35]首次報(bào)道制備的抗蛇毒IgY能有效中和蛇毒對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的致死毒性，其中和能力是商用馬源型抗體的6.3 倍，IgY對(duì)蛇毒表現(xiàn)出很好的中和效果。近年來(lái)，研究者們已經(jīng)開始研究用IgY替代針對(duì)不同種屬蛇毒的抗蛇毒血清，研究結(jié)果見表1。由此可見，用蛇毒免疫蛋雞可獲得高活性的抗蛇毒IgY，它不僅能有效中和蛇毒的致死效應(yīng)，也能中和蛇毒引起的多種毒理學(xué)效應(yīng)。此外，卵黃中抗蛇毒IgY含量高，據(jù)報(bào)道，18 只免疫的雞每年能夠產(chǎn)出的抗蛇毒血清與1 匹馬的產(chǎn)出量相當(dāng)[34]。因此，IgY被認(rèn)為是一種可能替代抗蛇毒血清的新型蛇毒解毒劑。

表 1 IgY對(duì)蛇傷治療的相關(guān)研究Table 1 Related applications of IgY against snake bites

4.2 IgY中和其他蛋白毒素研究

自然界許多動(dòng)物、植物和細(xì)菌都能產(chǎn)生大分子蛋白毒素。大分子蛋白類毒素很難直接跨膜進(jìn)入細(xì)胞，需通過(guò)內(nèi)化由細(xì)胞膜外進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而作用不同靶位發(fā)揮毒性作用，此過(guò)程往往借助受體完成，是蛋白毒素中毒的關(guān)鍵步驟[45]。利用IgY中和毒素的研究，目前大多限于大分子毒素。Leclaire等[46]用葡萄球菌分泌的腸毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）的兩個(gè)重疊片段免疫蛋雞產(chǎn)生IgY，該IgY可抑制被動(dòng)免疫小鼠的細(xì)胞因子反應(yīng)，使小鼠產(chǎn)生免疫保護(hù)力；且能使被動(dòng)免疫的恒河猴在含有致命劑量SEB的氣霧里存活4 h，對(duì)恒河猴起到一定的保護(hù)作用。陳翠萍等[47]采用幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）超聲裂解物和該菌培養(yǎng)液離心上清液濃縮后免疫蛋雞制備IgY，兩種抗體均能中和Hp毒素，可降低Hp蛋白抗原對(duì)Vero細(xì)胞的毒性作用；感染小鼠經(jīng)抗Hp-IgY口服治療4 周后，其陰轉(zhuǎn)率達(dá)100%，且肝臟病理切片顯示炎癥明顯減輕。Pauly等[48]采用蓖麻毒素免疫蛋雞得到高效價(jià)和特異性IgY，體外實(shí)驗(yàn)顯示抗蓖麻毒素IgY能預(yù)防蓖麻毒素誘導(dǎo)Vero細(xì)胞死亡；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)用抗體與毒素室溫孵育30 min的復(fù)合物注射BALB/c鼠，IgY與毒素復(fù)合物處理組大鼠存活率較毒素處理組升高。近幾年，較多研究采用大腸桿菌產(chǎn)生的志賀毒素免疫蛋雞制備IgY，探究其降毒效應(yīng)和解毒機(jī)制。de Almeida等[49]采用大腸桿菌J5株、內(nèi)毒素與類脂混合免疫蛋雞制備IgY，該抗體效價(jià)高、特異性強(qiáng)，防治內(nèi)毒素血癥效果明顯。此后，Wang Qin等[6]用志賀毒素亞型蛋白（StxB）免疫蛋雞獲得抗StxB-IgY，并采用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究抗StxB-IgY降低StxB毒性的作用，發(fā)現(xiàn)抗StxB-IgY能阻斷StxB與HeLa細(xì)胞膜上受體的結(jié)合，使共同孵育處理的HeLa細(xì)胞存活率增加；通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該抗體能降低Stx1對(duì)BALB/c鼠的毒性損傷。Parma等[50]用志賀毒素蛋白（Stx2）免疫蛋雞獲得抗體Stx2-IgY，中和毒性效應(yīng)顯示該抗體能很好地識(shí)別結(jié)合Stx2毒素，有效降低Stx2對(duì)Vero細(xì)胞的毒性，并且灌胃和注射IgY的方式可減輕Stx2對(duì)大鼠的毒性損傷。Neri等[51]用志賀毒素亞型蛋白（Stx1B和Stx2B）和兩種毒素亞型重組體蛋白（rStx1B和rStx2B）免疫蛋雞，得到相應(yīng)的抗Stx1B-IgY、抗Stx2B-IgY、抗rStx1B-IgY和抗rStx 2B-IgY，研究結(jié)果表明重組蛋白免疫的抗體特異性強(qiáng)，不存在交叉識(shí)別，中和能力較原抗體分別增強(qiáng)10 倍和2.6 倍。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，直接采用大分子蛋白毒素免疫蛋雞獲得的IgY，具備抗體與抗原特異性結(jié)合的特性，IgY能與大分子蛋白毒素結(jié)合在一起，阻斷蛋白毒素與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，減少細(xì)胞對(duì)毒素的攝入，起到對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用[52]（圖2）。

圖 2 IgY中和蛋白毒素誘發(fā)的細(xì)胞毒性機(jī)制Fig. 2 diagram of the mechanism of IgY for reducing macromolecular protein toxins-induced cytotoxicity

5 應(yīng)用前景

近十年來(lái)，脫除食品和飼料中毒素（特別是真菌小分子毒素）的方法主要包括：物理吸附法，化學(xué)法和生物酶解毒法[53]，然而這些方法存在穩(wěn)定性差、易導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失、產(chǎn)生次生有毒物質(zhì)、成本較高和運(yùn)輸條件苛刻等問(wèn)題[54]。因此，利用新型生物技術(shù)開發(fā)穩(wěn)定高效、無(wú)副作用以及環(huán)境友好的脫除方法是毒素脫除的一個(gè)重要發(fā)展方向。綜上所述，IgY中和大分子蛋白毒素作用明顯，相較于哺乳動(dòng)物IgG，IgY的生產(chǎn)成本低、純化工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)量大且穩(wěn)定性好，引發(fā)副作用的可能性低，IgY是一種極富前景的中和毒素資源。盡管如此，目前的研究主要集中于降低大分子蛋白毒素毒性，自然界還存在種類繁多的小分子毒素，小分子毒素污染源廣、毒性強(qiáng)，但目前鮮有IgY對(duì)小分子毒素中和作用的研究。因此，利用IgY的生物學(xué)優(yōu)勢(shì)和體內(nèi)代謝特點(diǎn)，探索其對(duì)小分子毒素的降毒效應(yīng)與解毒機(jī)制，能為開發(fā)生物友好的小分子毒素脫除方法提供一個(gè)嶄新的思路。另外，IgY因其具有的生物學(xué)特點(diǎn)和開發(fā)應(yīng)用方面的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)作為添加劑應(yīng)用于嬰幼兒食品和牲畜飼料，用于抵抗病毒和細(xì)菌性疾病的侵害。利用其口服方面的優(yōu)勢(shì)，作為食品和飼料添加劑對(duì)控制小分子毒素對(duì)公眾身體健康的影響具有重大意義?，F(xiàn)階段對(duì)于利用IgY中和毒素的研究還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，有必要推進(jìn)IgY的耐受性和對(duì)人應(yīng)用安全性的臨床實(shí)驗(yàn)。

6 結(jié) 語(yǔ)

不合理的食品和飼料加工、運(yùn)輸和貯藏方式易產(chǎn)生各種毒素，隨著人們對(duì)食品安全日益重視，降低食品和飼料中毒素毒性已經(jīng)成為保障公眾安全和畜禽健康的重要措施之一。IgY可有效識(shí)別大分子蛋白毒素，起到降低毒素毒性的作用。IgY作為嬰幼兒食品和動(dòng)物飼料添加劑已經(jīng)得到開發(fā)應(yīng)用，口服方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)越性，成為國(guó)內(nèi)外開發(fā)的一種重要、安全的營(yíng)養(yǎng)添加劑。隨著研究理論的不斷深入及科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，相信利用IgY與抗原特異性識(shí)別和結(jié)合的特性及其在應(yīng)用方面的優(yōu)勢(shì)，勢(shì)必能為降低食品和飼料中毒素毒性提供新的途徑。