王 凱，朱玉婕，李媛媛，戴宇峰，王玉明，王靜鳳*

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹饕±硖卣鞯穆酝诵行约膊1]。迄今為止，世界范圍內(nèi)有超過15億的OA患者，由此帶來的經(jīng)濟(jì)損失每年高達(dá)1 900億 美元[2-3]。作為合成軟骨基質(zhì)的單一細(xì)胞類型，軟骨細(xì)胞對于軟骨穩(wěn)態(tài)的維持起著重要的作用[4]。最近有研究表明OA患者的關(guān)節(jié)軟骨中，軟骨細(xì)胞開始發(fā)生肥大向分化，出現(xiàn)軟骨內(nèi)骨化進(jìn)程進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡[5]。因此，維持軟骨細(xì)胞的正常狀態(tài)對于OA的治療至關(guān)重要。

自噬是細(xì)胞應(yīng)對外部異常環(huán)境的一個重要的自我保護(hù)調(diào)節(jié)機制[6]。Caramés等報道在OA進(jìn)程中軟骨細(xì)胞自噬進(jìn)程發(fā)生紊亂，并且軟骨基質(zhì)流失加重[7]。OA小鼠中軟骨細(xì)胞自噬機制的缺失也會導(dǎo)致軟骨細(xì)胞異常凋亡增加[8]。本實驗中的高純度魚油（fish oil，F(xiàn)O）富含乙酯型n-3系多不飽和脂肪酸（n-3 polyunsaturated fatty acid，n-3 PUFA）。近來有研究表明n-3 PUFA對于哺乳動物雷帕霉素靶點（mammalian target of rapamycin，mTOR）（自噬負(fù)調(diào)節(jié)因子）有重要的調(diào)節(jié)作用[9]。Huang Minjun等報道Fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠關(guān)節(jié)組織中mTOR的表達(dá)量下降，自噬進(jìn)程被激活[10]?，F(xiàn)階段關(guān)于魚油對OA的報道僅局限在改善疼痛和抗炎方面[11-12]，關(guān)于魚油對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)還鮮有報道。本實驗采用手術(shù)方式建立內(nèi)側(cè)半月板不穩(wěn)（destabilization of the medial meniscus，DMM）小鼠OA模型，在動物體內(nèi)探究了乙酯型魚油對骨性關(guān)節(jié)炎軟骨退變的影響，進(jìn)一步研究了乙酯型魚油對軟骨細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用機制。本研究的主要意義在于為乙酯型魚油改善骨性關(guān)節(jié)炎軟骨退變進(jìn)程提供新的理論依據(jù)，也為乙酯型魚油的進(jìn)一步高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購于北京維通利華實驗動物有限公司。動物合格證號：SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)室進(jìn)行12 h光/12 h暗節(jié)律交替，保持通風(fēng)良好，控制飼養(yǎng)溫度在（23±1）℃，飼養(yǎng)期間，小鼠自由飲食。

高純度乙酯型魚油購自威海博宇漁業(yè)有限公司。

UNIQ-10 RNA柱式提取試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 美國Promega公司；TRIzol試劑及Maxima SYBR熒光染料 霍夫曼羅氏生物科技有限公司；蘇木精染料 藍(lán)季（上海）科學(xué)發(fā)展有限公司；醇溶性伊紅 上海試劑三廠；硫酸氨基葡萄糖 普愛生物工程（湖北）有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

iCycler iQ5系統(tǒng)Real-Time聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀 美國Bio-Rad公司；GL-20M高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器公司；RM2135型石蠟切片機 德國徠卡公司；DP72型顯微鏡成像系統(tǒng)、BH-2型顯微鏡 日本OLYMPUS公司；HD-200p型加熱器及氮吹設(shè)備 瑞士Blue Marlin公司；6890A型氣相色譜儀 美國Agilent科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魚油脂肪酸組成的測定

參照Ding Ning等[13]的方法，通過氣相色譜檢測脂肪酸組成：色譜柱采用HP-INNOWax石英毛細(xì)管柱（30 m×320 μm，0.25 μm），分流比20∶1，壓力62.47 kPa，流速1.19 mL/min；起始柱溫為170 ℃，后續(xù)按照3 ℃/min的速率升溫至210 ℃并保持15 min；檢測器采用火焰離子化檢測器，進(jìn)樣口和檢測器溫度均為240 ℃，載氣為氮氣（1.2 mL/min）。含總脂肪酸99.15%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）；其中，二十碳五烯酸49.29%、二十二碳六烯酸32.53%，二十碳五烯酸與二十二碳六烯酸質(zhì)量比約為3∶2。

1.3.2 骨性關(guān)節(jié)炎模型建立及動物分組

9 周齡雄性C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，手術(shù)方法構(gòu)建小鼠DMM骨性關(guān)節(jié)炎模型[14]。手術(shù)8 周后，將假手術(shù)組（Sham）設(shè)為正常對照組，DMM手術(shù)組隨機分為模型對照組（DMM）、陽性對照組（GLU，195 mg/kg mb），魚油低劑量組（FO-L，100 mg/kg mb）和魚油高劑量組（FO-H，200 mg/kg mb），每組10 只。Sham組和DMM組灌胃生理鹽水，陽性對照組灌胃硫酸氨基葡萄糖（glucosamine sulfate，GLU）。每天灌胃1 次，灌胃周期為60 d。

末次灌胃后禁食不禁水12 h，摘眼球處死小鼠，迅速分離小鼠右后肢（每組3 只），剔除肌肉后截取關(guān)節(jié)部分（保留關(guān)節(jié)囊）用于組織學(xué)觀察和測定；迅速分離右后肢（每組7 只），剔除軟組織及關(guān)節(jié)囊后迅速剝離關(guān)節(jié)軟骨入液氮速凍，并保存于-80 ℃用于實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）分析。

1.3.3 組織學(xué)觀察與分析

截取右后肢關(guān)節(jié)部分立即置于體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定液中，固定24 h，再將其放入10%乙二胺四乙酸二鈉（pH 7.3）中脫鈣3～4 周，每3 d更換脫鈣液，脫鈣后的關(guān)節(jié)組織于梯度乙醇溶液中脫水，常規(guī)石蠟包埋，行蘇木精-伊紅和甲苯胺藍(lán)染色，于顯微鏡下觀察軟骨結(jié)構(gòu)變化。使用imageJ軟件對軟骨負(fù)重區(qū)的透明軟骨（hyaline cartilage，HC）、鈣化軟骨（calcified cartilage，CC）厚度及總軟骨厚度進(jìn)行定量分析。使用OsteoMetrics分析軟件對軟骨面積進(jìn)行定量。小鼠關(guān)節(jié)軟骨損傷組織學(xué)評估參考國際骨關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會（Osteoarthritis Research Society International，OARSI）評分標(biāo)準(zhǔn)[15-16]。

1.3.4 qPCR分析

取出-80℃中保存的關(guān)節(jié)軟骨樣品，利用UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒提取其總RNA，取1 μg的總RNA，在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的催化作用下（反應(yīng)條件及體系參照逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV的說明書）逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。qPCR體系（25 μL）為：cDNA 5 μL、上下游引物各0.75 μL、雙蒸水6 μL、SYBR 12.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸45 s，共45 個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因。各目的基因的引物序列如表1所示。

表 1 軟骨代謝相關(guān)基因引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR ampli fi cation of cartilage metabolism-related genes

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用最小顯著性差異法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05時為顯著差異，最終結(jié)果用 ±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酯型魚油能顯著改善骨性關(guān)節(jié)炎小鼠的軟骨結(jié)構(gòu)，抑制軟骨退變進(jìn)程

圖 1 骨性關(guān)節(jié)炎小鼠的關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)組織形態(tài)學(xué)分析Fig. 1 Histomorphological analysis of articular cartilage in mice with osteoarthritis

由圖1A、E可知，相對于Sham組，DMM組軟骨結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，蛋白多糖流失加重，提示關(guān)節(jié)炎小鼠出現(xiàn)明顯的軟骨退變現(xiàn)象。另外，OARSI評分顯著升高也進(jìn)一步說明這一結(jié)果（圖1F）。FO干預(yù)后，透明軟骨厚度、HC/CC比例相對DMM組平均上升了125.73%和152.03%（P＜0.01）。鈣化軟骨厚度平均降低10.66%（P＜0.05）。軟骨面積和厚度分別增加了61.63%和31.88%，OARSI評分較DMM組平均降低42.19%（P＜0.01）。以上結(jié)果綜合說明FO能夠明顯改善OA小鼠的軟骨結(jié)構(gòu)，抑制軟骨退變，維持軟骨基質(zhì)成分的穩(wěn)定。

2.2 乙酯型魚油能夠促進(jìn)軟骨合成代謝關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)水平

圖 2 乙酯型魚油對軟骨合成代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Fig. 2 Effect of FO on relative mRNA expression of key anabolism-related genes

聚集蛋白多糖（aggrecan，Acan）和II型膠原是構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨的主要成分[17]。如圖2所示，DMM組Acan和Col2α1的mRNA表達(dá)水平較Sham組極顯著降低（P＜0.01），說明在OA病理進(jìn)程中軟骨基質(zhì)的合成代謝受到抑制。給予FO干預(yù)后，Acan和Col2α1的表達(dá)水平明顯上升，并且有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，F(xiàn)O-H組Acan和Col2α1 mRNA的表達(dá)量較DMM組分別極顯著升高197.24%和107.95%（P＜0.01）。以上結(jié)果提示FO能夠上調(diào)軟骨基質(zhì)的主要成分Acan和Col2α1的mRNA表達(dá)水平，改善軟骨基質(zhì)的合成代謝過程。

2.3 乙酯型魚油能夠抑制軟骨細(xì)胞成熟肥大相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平

圖1中DMM組鈣化軟骨區(qū)面積的增加，HC/CC比例降低，肥大軟骨細(xì)胞聚集且增多，提示正常軟骨細(xì)胞肥大態(tài)分化進(jìn)程開始增加。Col10α1[18]、Runx2[19]是調(diào)控軟骨細(xì)胞肥大成熟的關(guān)鍵因子。

圖 3 乙酯型魚油對軟骨成熟肥大相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Fig. 3 Effect of FO on relative mRNA expression of key cartilage hypertrophy-related genes

由圖3可知，相對于Sham組，DMM組Col10α1、Runx2的mRNA的表達(dá)水平極顯著升高（P＜0.01），進(jìn)一步說明了OA進(jìn)程中關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞出現(xiàn)明顯的成熟肥大向分化。經(jīng)不同劑量的FO干預(yù)后，軟骨組織Col10α1和Runx2 mRNA的平均表達(dá)水平較DMM組分別降低27.52%和32.88%（P＜0.01），以上結(jié)果提示FO能夠顯著抑制OA進(jìn)程中關(guān)節(jié)軟細(xì)胞的成熟肥大。

2.4 乙酯型魚油能夠調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)水平

軟骨細(xì)胞成熟肥大分化會進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡及軟骨基質(zhì)的降解[20]。圖1的蘇木精-伊紅染色結(jié)果也顯示軟骨細(xì)胞凋亡后不能充滿陷窩而導(dǎo)致無細(xì)胞區(qū)空洞增多。Bax、Bcl-2和Caspase3是軟骨細(xì)胞重要的凋亡調(diào)節(jié)因子[21-22]。

如圖4所示，與Sham組相比，DMM組Bax和Caspase-3的mRNA表達(dá)量極顯著上升（P＜0.01），而抗凋亡因子Bcl-2的mRNA表達(dá)水平顯著下降，提示關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡進(jìn)程被激活。FO干預(yù)后能明顯改善這一趨勢，F(xiàn)O-H組的Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)量較DMM組分別下降了27.11%和38.45%（P＜0.01），Bcl-2的表達(dá)量較DMM組升高了63.82%（P＜0.01）。以上結(jié)果共同說明FO能夠抑制軟骨中促凋亡關(guān)鍵基因的表達(dá)，促進(jìn)抑凋亡關(guān)鍵基因表達(dá)，從而抑制OA病理中關(guān)節(jié)軟骨的異常凋亡進(jìn)程。

圖 4 乙酯型魚油對軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of FO on relative mRNA expression of key apoptosis-related genes

2.5 乙酯型魚油能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平

自噬是軟骨細(xì)胞抵御外部異常環(huán)境變化時的正常自我保護(hù)調(diào)節(jié)機制[6]。mTOR是自噬進(jìn)程的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子[23]，LC-3B和ATG-5是調(diào)節(jié)自噬進(jìn)程的關(guān)鍵基因[24]。

圖 5 乙酯型魚油對軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of FO on relative mRNA expression of key autophagy-related genes

如圖5所示，DMM組的mTOR表達(dá)量較Sham組極顯著升高（P＜0.01），而LC-3B和ATG-5的表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01），提示OA中mTOR出現(xiàn)異常高表達(dá)并抑制了軟骨細(xì)胞的自噬進(jìn)程。不同劑量的FO均能改善這一情況，并有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。FO-L組和FO-H組的mTOR mRNA表達(dá)量較DMM組平均下降了26.05%（P＜0.05），LC-3B和ATG-5的mRNA表達(dá)量分別升高了57.71%和50.34%（P＜0.01）。這表明FO能夠顯著下調(diào)OA進(jìn)程中自噬抑制因子mTOR的表達(dá)水平從而激活軟骨細(xì)胞自噬進(jìn)程，維持軟骨細(xì)胞的正常表型，從而抑制軟骨退變。

3 討 論

本實驗采用手術(shù)方法構(gòu)建DMM小鼠OA模型，在動物實驗水平探究了FO對小鼠OA進(jìn)程中軟骨退變的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)O能夠顯著改善軟骨結(jié)構(gòu)，維持軟骨基質(zhì)成分的穩(wěn)定。同時，F(xiàn)O能夠維持正常軟骨細(xì)胞狀態(tài)，抑制軟骨細(xì)胞的肥大分化和異常凋亡，機制探究表明FO能夠顯著上調(diào)自噬因子的表達(dá)。以上結(jié)果提示FO能激活軟骨細(xì)胞自噬來維持關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)，抑制OA中的軟骨退變進(jìn)程。

軟骨退變是骨性關(guān)節(jié)炎中一個重要的病理特征，主要表現(xiàn)為軟骨結(jié)構(gòu)的損傷和基質(zhì)成分的丟失[1]。作為合成軟骨基質(zhì)的單一細(xì)胞類型，軟骨細(xì)胞對于軟骨穩(wěn)態(tài)的維持起著重要的作用[4]。正常狀況下，軟骨細(xì)胞通過分泌II型膠原和蛋白多糖等軟骨基質(zhì)成分來維持軟骨的完整性[14]。近來，Sampson等發(fā)現(xiàn)在骨性關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)程中，軟骨細(xì)胞發(fā)生成熟肥大向分化，合成X型膠原和Runx-2等因子，進(jìn)而啟動軟骨內(nèi)骨化進(jìn)程[5]。本實驗中，DMM組鈣化軟骨區(qū)面積明顯增加，同時，關(guān)節(jié)軟骨中肥大調(diào)節(jié)因子Col10α1、Runx-2的mRNA表達(dá)水平明顯上升，提示OA病理進(jìn)程中軟骨肥大化加劇，啟動了軟骨內(nèi)骨化進(jìn)程。與此相關(guān)，軟骨正常合成代謝調(diào)節(jié)因子Acan和Col2α1的表達(dá)也受到抑制。FO的干預(yù)能夠明顯抑制相關(guān)肥大因子的表達(dá)，抑制軟骨細(xì)胞的成熟向分化，結(jié)合Acan和Col2α1的表達(dá)情況共同說明FO能夠維持軟骨細(xì)胞的正常表型，從而抑制軟骨的退變。

軟骨細(xì)胞成熟肥大分化會進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡及軟骨基質(zhì)的降解[25]。Sakata等報道OA患者軟骨中細(xì)胞凋亡信號明顯增強，抑制軟骨細(xì)胞的非正常凋亡能夠減少軟骨基質(zhì)成分的流失[26]。Lee等報道EPA能夠通過降低P53介導(dǎo)的凋亡關(guān)鍵基因Bax、Caspase-3的表達(dá)來抑制OA中的軟骨細(xì)胞異常凋亡進(jìn)程[27]。Bcl-2是Bcl家族的重要成員，能夠結(jié)合Bax并抑制其活性表達(dá)，是重要的抗凋亡因子[28]。本實驗的結(jié)果顯示，F(xiàn)O的干預(yù)能夠顯著降低Bax、Caspase-3的mRNA表達(dá)，提高抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)，從而阻斷軟骨細(xì)胞的異常凋亡進(jìn)程。

自噬是軟骨細(xì)胞應(yīng)對外部異常環(huán)境變化的一個重要的自我保護(hù)調(diào)節(jié)機制[4]。Caramés等報道自噬是正常軟骨的重要保護(hù)機制，年齡引起的自噬機制缺失會引起軟骨細(xì)胞異常凋亡并引發(fā)OA[29]。mTOR是一種Ser/Thr蛋白激酶，眾多研究發(fā)現(xiàn)mTOR是重要的自噬負(fù)性調(diào)節(jié)子[22,30]。Huang Minjun等報道，F(xiàn)at-1轉(zhuǎn)基因小鼠（n-6 PUFA轉(zhuǎn)化為n-3 PUFA）關(guān)節(jié)組織中mTOR的表達(dá)受到抑制[10]。本實驗采用的FO中富含乙酯型n-3 PUFA，其中EPA和DHA的含量分別為49.29%和32.53%。研究結(jié)果顯示FO干預(yù)后能顯著降低關(guān)節(jié)軟骨中mTOR的表達(dá)水平，同時能夠顯著提高自噬關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子LC-3及ATG-5的表達(dá)水平。以上結(jié)果綜合表明FO通過降低mTOR的表達(dá)來激活關(guān)節(jié)軟骨中軟骨細(xì)胞自噬進(jìn)程、維持細(xì)胞正常狀態(tài)，進(jìn)而維持軟骨穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，F(xiàn)O能夠顯著改善DMM誘導(dǎo)的骨性關(guān)節(jié)炎小鼠中的軟骨結(jié)構(gòu)，抑制軟骨退變，維持正常軟骨細(xì)胞狀態(tài)，其機制可能與激活軟骨細(xì)胞自噬來抑制其異常肥大、凋亡進(jìn)程有關(guān)。