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(1.福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002;2.福建農林大學海洋研究院,福建福州 350002;3.福建農林大學國家菌草工程技術研究中心,福建福州 350002)

海洋單細胞藻類即微藻,是地球上出現最早的生物物種,由于種類不同,它們的尺寸從幾微米到幾百微米不等[1]。微藻的種類繁多,已知的海洋微藻種屬被分為綠藻門、金藻門、甲藻門、紅藻門和藍藻門5個主門,門下設綱,主要分為綠藻綱(Chlorophycreae)、金藻綱(Chrysophyceae)、硅藻綱(Bacillariophyceae)、定鞭金藻綱(Prymnesiphyceae)、甲藻綱(Pyrrophyceae)、紅藻綱(Rhodophyceae)、藍藻綱(Cyanophyceae)等[2]。根據微藻的生活方式,可分為浮游微藻和底棲微藻兩大生態(tài)類群;根據微藻生長環(huán)境的不同,又可分為水生微藻、陸生微藻與氣生微藻三種生態(tài)類群[3]。微藻作為低等植物可以生長在海洋、河流以及湖泊里,適應環(huán)境能力強、生長周期短、產量高。它能有效地利用太陽能將H2O、CO2和無機鹽類轉化為有機物,是地球有機資源的初級生產者[1]。微藻的生長不會與其他油料作物爭奪土地,節(jié)省土地資源?？梢岳眠呺H陸地、廢棄湖泊、廢水和CO2,有利于環(huán)境治理。

微藻中含有蛋白質、脂肪、碳水化合物和維生素等人類所必需的營養(yǎng)素,油脂含量較高,中性脂的含量約占細胞干重的20%～50%,少數微藻可達75%,單位產油量顯著高于農業(yè)油料作物。因此微藻油被認為是最具發(fā)展?jié)摿Φ挠椭Y源,在國際上受到極大關注[4]。但是大部分微藻細胞壁由纖維素和果膠組成,比較堅韌,阻礙細胞內油脂的萃取,因而在微藻油萃取前需對微藻進行破壁處理以提高微藻油提取率。另外,油脂在微藻細胞中的分布和組成受微藻種類及生長環(huán)境的影響,很難采用統(tǒng)一的方法高效萃取微藻油[5]。在微藻常見的門類中,硅藻門、綠藻門、金藻門等門類中油脂含量較高。在綠藻門中培養(yǎng)較多的有小球藻、擬微球藻、萊茵衣藻、雨生紅球藻等,其中擬微球藻油脂含量最高;常見的硅藻種類有三角褐指藻、角毛藻、小新月菱形藻、小環(huán)藻等,其中三角褐指藻油脂含量最高;培養(yǎng)較多的金藻有鹽生巴夫藻、路氏巴夫藻等,其中路氏巴夫藻含油量更高一些[6]。綠藻門微藻和硅藻門微藻的平均總脂含量大概為干重的26%,金藻門微藻主要分布在淡水中,其平均總脂含量高于綠藻門和硅藻門的[7]。

目前常用的藻油萃取技術有水酶法[8]、反復凍融法[9]、超聲、微波法[10]、超臨界流體萃取法、亞臨界萃取法、微負壓法等[11]。隨著微藻油提取和檢測技術的深入研究,人們也越來越重視其功能特性的研究。微藻油中含有豐富的多不飽和脂肪酸,其含量遠高于魚類,且具有抗炎癥、抗腫瘤、調節(jié)血脂和血糖、提高免疫力、預防心血管疾病等功能[12]。目前,微藻油主要應用于飼料業(yè)、食品、營養(yǎng)保健品、生物柴油等領域。本文主要綜述了近年來微藻油提取方法及其功能的研究進展,通過介紹各種微藻油提取方法的優(yōu)缺點及其多不飽和脂肪酸的功能特性,進而為微藻油研究工作提供一定的參考。

1 微藻油的提取方法

海藻油是海藻中全部油類物質的總稱,常溫下多為略帶腥味的淡黃色液體。海藻按其大小可分為大型藻類和微藻類,微藻油含量較高,而以大型海藻為原料提取油脂的報道較少[13]。微藻是真核生物,細胞壁結構具有多樣性,細胞壁的存在阻礙了提取溶劑進入細胞,從而降低微藻油的提取效率,因此微藻難以破壁是微藻油提取的關鍵技術瓶頸。破壁方法分為機械方法和非機械方法;機械方法主要包括超聲波法、珠磨法、反復凍融法、高壓勻漿法、微波法、脈沖電場法、蒸汽噴發(fā)法、水熱汽化等;非機械方法主要包括酸法、酶法、離子液法、納米粒法、滲透沖擊法和表面活性劑等方法;將機械方法和非機械方法簡單的劃分又可分為化學法、物理法、物理化學法和生物法四種方法[14]。

1.1 化學法

化學法提取微藻油是指通過使用化學試劑來破壞細胞壁,從而提取出細胞內脂質,通常被認為是一種低能耗、低投資、易于擴大規(guī)模的方法;但是在實際操作中仍有許多問題待解決,例如化學試劑的生物毒性,脂質降解等方面的問題;由于不同種類的海藻細胞壁的結構組成和強度不同,因此要根據海藻類別選擇合適的化學試劑,否則會對海藻油的提取效率產生影響[15]。

1.1.1 有機溶劑法 Choi等[16]用三種有機溶劑系統(tǒng):己烷、己烷/甲醇(7∶3,v/v)、氯仿/甲醇(1∶1,v/v)混合后提取脂質,混合有機溶劑與小球藻以19∶1的質量比混合后,經過攪拌、離心后,脂質的提取率達到378 mg/g。Lee等[17]開發(fā)了一種利用二甲基碳酸二甲酯(DMC)提取脂質的高效方法,DMC和甲醇混合物(7∶3,v/v)從干的微藻中脂質提取率可達到38.9%。

微藻油的提取是在有機溶劑提取為基礎的酯交換過程,但是在酯交換之前要除去有機溶劑,進行溶劑回收,因此可以通過溶劑回收的工藝來降低總成本并避免有機溶劑對藻油的安全性產生影響。Dos Santos等[18]比較了四種不同的溶劑體系(乙醇,己烷和兩種氯仿/甲醇比例不同的混合物),脂質產量達到190 mg/g。利用化學溶劑萃取產油微藻中的油脂,具有操作簡單便捷,易于油脂分離的優(yōu)點。雖然化學試劑具有高度選擇性和對油脂較好的溶解性,但是耗時長,易受有機溶劑在微藻粉中的分散性及兩者接觸面的影響。

1.1.2 酸法 微藻細胞的細胞壁中的糖聚合物可被適當濃度的酸分解,特別是硫酸,由于其高效和低成本的優(yōu)點,常用于化工業(yè)[19]。2014年,Park等[20]研究了硫酸作為催化劑從小球藻中提取脂質的方法,在120 ℃熱處理60 min的條件下,脂質提取產率高達337 mg/g。劉穎[21]利用2 mol/L的鹽酸破壞微藻細胞,其破碎效果明顯,油脂提取率可達到65%,且酸濃度越高破碎效果越明顯。由于酸易破壞細胞內的有效成分,所以一般不選擇高濃度的強酸用于微藻的生物煉制,因此在酸法提取的過程中首先要選擇適合相應微藻的試劑,同時要選擇適宜的配比和適宜的濃度。

1.2 物理法

物理法提取海藻油主要是指利用物理或機械的方法破壞海藻的細胞壁,如能量轉移(超聲波和微波)、固體剪切(珠磨法)、液切變(高壓勻漿法)和熱壓法(蒸汽噴發(fā)、水熱汽化)等方法[14]。物理法需要以剪切力、電脈沖或熱量等形式進行能量輸入,具有高產品回收率、良好的可控性和可擴展性的優(yōu)點。由于高壓或剪切應力或溫度會損壞揮發(fā)性細胞內化合物,因此一些物理方法不適合于這些化合物,但適用于脂質。可采用物理方法與化學方法相結合,以減少能源消耗,提高破碎微藻細胞壁的效率[14]。

1.2.1 超聲波和微波法 超聲波法是將超聲波傳遞至細胞內,利用聲波傳遞的作用在細胞表面產生較大的動能,從而達到破碎細胞的效果,以2×104～2×109Hz的聲波進行工作,具有熱效應、機械效應和空化效應,而超聲波對萃取分離的強化作用主要來源于超聲空化。利用超聲波和有機萃取的方法提取海藻油是現在比較常用也是提取效率較高的一種方法,Piasecka等[22]利用了超聲波破壞細胞,隨后利用氯仿/甲醇提取小球藻油,脂質提取率高達422 mg/g。除了利用超聲波提取海藻油,微波也是現在常用的方法。

微波是一種頻率為300 M～300 GHz的電磁波通過樣品發(fā)生激活作用而使其與機體分離。Cheng等[23]利用微波法破壞細胞壁,從小球藻中提取藻油的提取率為5%～18.7%,而常規(guī)使用氯/甲醇的方法脂質提取率為20.4%,相比較而言,微波法的提取效果較差。這可能是由于微波提取使用的是濕細胞,而傳統(tǒng)方法使用的是干細胞。

徐椿慧等[24]利用超聲波-微波協同萃取法提取混合海藻粉(滸苔、海帶、小球藻)中海藻油,根據不同因素進行單因素實驗,確定了超聲功率100 W、提取時間40 min、提取溫度45 ℃、料液比1∶3 g/mL、微波功率250～400 W為最佳提取工藝條件,同時也發(fā)現單獨使用超聲波或微波不如超聲波-微波聯合使用的效果好。超聲波法和微波法是用于破碎微藻細胞壁的有效方法,但是由于耗能較高,在今后的放大生產中還有很大的阻力。

1.2.2 珠磨法 珠磨法是將細胞懸浮液與玻璃珠進行混合,通過物理摩擦達到破碎細胞的效果。珠磨破壞微藻細胞壁是一種在液態(tài)環(huán)境中提取微藻細胞內脂質的有效手段。鑒于其在單程操作中的高中斷效率,易于放大程序和低勞動強度,珠磨具有很高的工業(yè)實施潛力[25]。孫珊[26]比較了研磨法、凍融法、乙醚石油醚法、氯仿甲醇法和酸熱法5種方法與有機溶劑組合對4種微藻(金藻、前溝藻、異灣藻、原甲藻)油脂提取率的影響,結果發(fā)現四種微藻使用凍融法破壁效果最好。2016年,Taleb等[27]通過觀察高壓珠磨破碎器破碎1 L培養(yǎng)液中微擬球藻細胞的破壁程度,發(fā)現細胞壁破碎率達到98%，因此,珠磨法更適用于提取液態(tài)環(huán)境中的微藻脂質。

1.3 物理化學法

物理化學方法提取海藻油是指在有機溶劑的存在下,利用超聲波、微波、均質等物理方法破壞海藻細胞。Santos等[28]利用超聲波輔助氯仿-甲醇提取小球藻油,微藻油的提取率達到19%,在這些脂類中甘油三酯的占比達到55%。Neto等[29]使用超聲輔助己烷從干燥的小球藻中進行脂質提取,得到155 mg/g的脂質產率。Piasecka等[21]報道,在己烷/甲醇和氯仿/甲醇混合物條件下,超聲輔助處理小球藻,其油脂提取率達到42%。

將物理和化學兩種萃取技術聯合使用可以強化溶劑萃取微藻油的效率,如超聲強化超臨界法、超聲輔助有機溶劑法等。多種技術的聯用可以顯著地提高海藻油的萃取效率,但也會使海藻油的生產工藝更加復雜,能耗和成本增大。

1.4 生物法

生物法是指利用生物預處理的方法將海藻的細胞壁進行酶解破壞,釋放出油脂,同時有效回收功能成分的一種方法。微藻細胞壁的破壞可以通過裂解酶或溶藻酶處理的生物學方法來實現。生物法主要優(yōu)點是生物學特異性、操作條件溫和及能量消耗低等。

1.4.1 酶法和水酶法 酶法是生物法中最具有代表性的一種方法,且酶法破碎細胞的研究技術也已相當成熟。酶法破碎細胞主要是自溶或體外酶進行酶解。自溶法是通過破壞肽聚糖結構,使細胞壁孔隙增加,從而造成細胞的裂解。體外酶法主要是指一些體外的生物酶,包括纖維素蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶等。Wang等[30]發(fā)現在超聲輔助下酶解法提取微擬球藻(Nannochloropsis)的油脂,其提取率達到38%。

水酶法是在酶法的基礎上新興的一種油脂提取方法,主要利用機械破碎油料,以水為分解相,采用相關的酶(如蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、維生素酶等)在水相中水解油料細胞壁從而使油脂從油料中釋放出來[8]。劉穎[20]發(fā)現在一定條件下使用4 g/L的中性蛋白酶水解小球藻,其油脂提取率可達80%以上。吳兵兵等[31]在一定條件下采用兩步酶法提取裂壺藻油,清油得率達到90.22%。張雨倩等[32]在酶添加量2%、料液比1∶25、酶解時間2 h、提取溫度為45 ℃的條件下進行實驗,藻油提取率達17.1%。榮輝等[33]采用水酶法從裂壺藻粉提取裂壺藻油,在料液比1∶7,中性蛋白酶添加量7%,堿性蛋白酶添加量10%的條件下清油得率為91.37%±0.14%。生物法與物理、化學方法相比,提取率高,油脂品質較好,同時能有效回收蛋白質等功能成分,但是酶的使用使得油脂的提取成本大大增加,同時藻種的不同和酶的選擇都會對油脂的提取率產生很大的影響。

1.4.2 微生物法 微生物法是一種高效、低成本的藻細胞破碎預處理方法,其中具有代表意義的是能夠對某些微藻起到特定破壞作用的細菌法,即溶藻菌法。溶藻菌是指能夠抑制藻類生長或殺死藻類、溶解藻細胞細菌的統(tǒng)稱。溶藻菌法是一種新興的提取微藻油的方法,但我國目前對此的研究較少,大部分研究集中在溶藻菌株的分離鑒定、溶藻方式的探討以及溶藻活性物質的分離純化等方面[34]。Chen等[35]在利用小球藻與細菌(Flammeovirga yaeyamensis)共培養(yǎng)所獲得的上清液對小球藻進行細胞破壁處理,由于共培養(yǎng)液中含有一些水解酶(即淀粉酶,纖維素酶和木聚糖酶),因此小球藻油提取率達到100%,章瑩穎等[36]通過比較不同破壁方法對微藻細胞破碎和油脂提取效果的影響,發(fā)現溶藻菌有較好的細胞破壁效果,能提高油脂提取率。酶法和微生物法是生物法中較常見的兩種方法,前者較后者研究更深入一些,溶藻菌的使用機制還需要進一步的研究探討,從而為其進一步的應用提供理論基礎。

2 微藻油的營養(yǎng)功能

脂類不僅是構成細胞膜的重要結構成分,也是所有生物生長不可或缺的營養(yǎng)成分,在能量儲存中起著重要作用[37]。近年來,海洋生物脂類被發(fā)現具有特有的功能特性,因為海洋環(huán)境的特殊性,導致海洋生物脂類的化學結構、作用機理、功能特性等方面與陸地生物脂類具有顯著的差異,具有自身特有的生理功能,如抗腫瘤、降血脂、增強智力、預防代謝綜合征等。因此從海洋生物中獲得天然脂類,是未來的重點研究方向[38]。微藻油是一種從海洋微藻中提取得到的天然保健食品,富含ω-3系多不飽和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acid,ω-3 PUFA),主要包括二十二碳六烯酸(Decosahexaenoic acid,DHA)和二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA),相對含量如表1所示[39]。海藻油相比魚油腥味較淡、污染物殘留少、DHA含量更高,因而備受消費者喜愛,市場競爭力優(yōu)勢明顯。研究發(fā)現[40],微藻油中不僅含有DHA、EPA等不飽和脂肪酸,而且還含有對人體健康有益的烴類和微量的醇類成分,其中角鯊烯和亞麻醇在微藻油中均有被檢測出。

表1 四種微藻油中DHA、EPA的相對百分含量Table 1 Relative percentage contents of DHA and EPA from four kinds of microalage oil

2.1 微藻油中DHA、EPA的功能

DHA和EPA,同屬于ω-3多不飽和脂肪酸,是大腦、神經和視覺細胞中重要的脂肪酸成分。這兩種不飽和脂肪酸不僅是構成高等動物細胞的重要成分[41],而且對人體健康有著不可忽視的作用。DHA和EPA主要來源于DHA、EPA藻油。DHA、EPA藻油作為一種新型的脂質食品原料,在調制乳、食用油、保健食品、蛋糕、飲料等諸多食品領域均有應用。2010年3月,中華人民共和國衛(wèi)生部第3號文件批準裂壺藻生產的DHA藻油作為一種新資源食品,推薦純DHA食用量300 mg/d[42]。司華靜等[43]發(fā)現DHA藻油與花生油混合后,不會影響花生油的口感和性質,還會降低花生油加工過程中DHA的損失率。黃巍峰等[44]研究DHA藻油對酸奶品質的影響,在30 d的儲存保質期內藻油添加量為0.25 mg/g時,產品的感官品質比較穩(wěn)定,不會出現藻腥味。DHA能增強記憶力,因而能提高學習效果,被稱作“腦黃金”。Stordy等[45]研究表明DHA對成年人的大腦功能和行為反應也有重要的影響。藻油中的DHA還能降血脂,降低膽固醇,預防心血管疾病,在國際上高純度DHA作為降血脂的藥物,已經被《美國醫(yī)師用藥手冊PDR》列為防治高血脂的第四類參考用藥。Nelson等[46]研究表明,給高血脂的人每天食用1.5 g DHA,2～15周之后,甘三酯含量降低了14%～26%,高密度脂蛋白含量有明顯的上升趨勢。代榮陽等[47]研究發(fā)現藻油中的EPA具有抗炎的作用,經常食用含有EPA食物的人,患風濕性關節(jié)炎、牛皮癬等慢性炎癥性疾病的機率較低。劉敬華等[48]研究發(fā)現,DHA可以通過p53依賴Fas介導途徑誘導HepG2細胞凋亡。

2.2 微藻油中角鯊烯的功能

角鯊烯(Squalene)又稱鯊烯、三十碳六烯、魚肝油萜、Spinacene,是一種高度不飽和烴類化合物,也是一種脂質不皂化物。其化學名稱為2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯,分子式為C30H50,相對分子量為410.7,屬開鏈三萜。角鯊烯因其特殊的生物功能和藥理作用而在藥物和功能食品等相關領域中發(fā)揮著重要作用[49]。角鯊烯主要來源于深海鯊魚油和橄欖油中,石金娥等[50]的研究發(fā)現,非復合型藻油中角鯊烯的含量達到4.13 g/kg,相比于角鯊烯含量之最的橄欖油中平均含量(3.83 g/kg),其角鯊烯的含量相當可觀。鯊烯作為一種無毒性的且具有防病治病作用的海洋生物活性物質,在體內具有抗炎癥、抗腫瘤、調節(jié)血脂和血糖等多種功能[51]。Liu等[52]發(fā)現角鯊烯通過調節(jié)糖脂代謝對心血管等代謝性疾病進程具一定調節(jié)作用。邱春媚等[53]發(fā)現角鯊烯具有耐缺氧的功能,同時并未發(fā)現角鯊烯的任何毒副作用。但是目前對于角鯊烯功能的研究主要集中在植物油脂和鯊魚肝油來源的角鯊烯,對于藻油來源角鯊烯的功能鮮有涉及。

2.3 微藻油的其它功能

食品方面,微藻油可以作為功能性營養(yǎng)強化劑或直接做成保健產品。醫(yī)藥方面,微藻油中的功能性多不飽和脂肪酸可以作為藥物使用。在養(yǎng)殖業(yè)中,微藻油可以加入飼料中,從而得到我們想要的功能性農副產品。一些含有功能性多不飽和脂肪酸的微藻油還具有改善精神分裂癥狀、治療皮膚病等多種生理功能[54]。目前微藻油中的亞油酸和花生四烯酸在醫(yī)學領域運用相當廣泛,對治療高血壓、緩解支氣管哮喘、鼻充血以及消化系統(tǒng)潰瘍等疾病療效十分顯著[55]。同時微藻油中的多不飽和脂肪酸可以用于藻脂代謝的研究,目前研究較好的是單細胞綠藻萊茵衣藻(Chlamydo-monasreinhardtii)[56]。

3 結語與展望

本文主要概述了近幾年微藻油的四種提取方法,分別是化學法、物理法、生物法和物理-化學法?；瘜W法、物理法與生物法雖各有各自的優(yōu)點,但是也存在各自的弊端。因此,將兩種或多種萃取技術聯合使用,如超聲-微波協同萃取技術、超聲強化超臨界萃取法、超聲輔助酶解法等,是提高海藻油萃取效率的有效途徑。多種技術的聯用能夠將其優(yōu)點結合起來,但是操作較為復雜,能耗較高。生物法因具有能耗低、操作簡單和安全性較高的特點,在未來微藻油的產業(yè)化生產具有較大的優(yōu)勢,但是生物法的溶藻機制研究還不夠深入,因此生物法的溶藻機制成為了現在待攻克的難題。隨著人們對微藻油中功能性物質認識的不斷加深,ω-3多不飽和脂肪酸和ω-6多不飽和脂肪酸功能的研究越來越深入,但是微藻來源的角鯊烯功能研究較少。研究發(fā)現不同藻油中活性物質甘油三酯與降血脂、抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力、健腦益智等功能有密切關系,且其結構類型存在差異功能也有很大不同,因此藻油中不同結構的甘油三酯活性有待進一步探究。