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(1.徐州工程學院食品(生物)工程學院,江蘇徐州 221018;2.江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設實驗室,江蘇徐州 221018)

酒精性肝病(Alcoholic liver disease,ALD)為我國第二大肝病,初期表現(xiàn)為脂肪肝,進而發(fā)展成肝炎、肝硬化等[1]。氧化應激引起的機體抗氧化防御系統(tǒng)受損和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增加,被認為在ALD發(fā)病機制中扮演重要角色[2]。肝臟是乙醇代謝的主要場所,長期大量飲酒可產(chǎn)生過量的活性氧和過氧化產(chǎn)物,使肝組織中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)等抗氧化酶活性下降,造成肝細胞損傷[3]。攝入外源抗氧化劑,提高機體抗氧化能力,消除酒精所致的氧化應激,被認為是ALD的有效療法之一[4]。近年來,在酒精性肝損傷治療藥物的篩選中,天然產(chǎn)物中的三萜類物質(zhì)受到廣泛關注,從靈芝[5]、茯苓[6]、北五味子[7]、蕨麻[8]和垂盆草[9]等大型真菌和植物中分離得到的三萜已被證實具有較好的保肝作用。

東方栓孔菌(Trametesorientalis)為多孔菌科栓孔菌屬真菌,可用于肺結核和支氣管炎等疾病的治療[10]。子實體中蛋白含量高約18.01%,脂肪含量低約1.58%,氨基酸組成合理,富含多種礦質(zhì)元素[11]。多糖和三萜是東方栓孔菌的主要活性成分,東方栓孔菌多糖具有較好抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性[12-13],有關東方栓孔菌三萜的研究卻較少。東方栓孔菌子實體中三萜含量約3.52%,高于茯苓、靈芝中的三萜含量,具有較好的體外抗氧化活性[11]。目前有關較高純度的東方栓孔菌三萜類物質(zhì)的富集工藝及體內(nèi)生物活性的研究鮮有報道。大孔樹脂吸附法具有高效、經(jīng)濟、易再生等優(yōu)點,廣泛用于天然產(chǎn)物中多酚、黃酮和三萜等某一類化合物總組分的純化,大孔樹脂純化三萜類物質(zhì)應用廣泛,許多研究者已經(jīng)成功利用大孔樹脂對三萜類化合物進行純化和富集[14-16]。

本文采用大孔吸附樹脂法對東方栓孔菌三萜粗提物的純化工藝進行優(yōu)化,并探究了經(jīng)大孔樹脂純化后的東方栓孔菌三萜對酒精致急性肝損傷小鼠的保護作用,旨在為東方栓孔菌三萜的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

東方栓孔菌子實體 吉林樺甸;昆明小鼠(SCXK魯20140007) (20±2) g,濟南朋悅實驗動物繁育有限公司;丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate aminotransferase,AST)、SOD、CAT、GSH-Px、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)測試盒 南京建成生物工程研究所;水飛薊賓 天津天士力圣特制藥有限公司;熊果酸(CAS77-52-1) 上海生工生物試劑;5種供試大孔樹脂的部分特性見表1;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

表1 五種不同大孔樹脂的部分特性Table 1 Partial properties of five different macroporous resins

723C可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;DCTZ-2000多用途恒溫超聲提取機 北京弘祥隆生物技術股份有限公司;LGJ-18A 冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠;HL-2恒流泵 上海嘉鵬科技有限公司;TGL-16臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀有限公司;1.6 cm×30 cm層析柱 上海廈美生化科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗三萜的提取與含量測定 東方栓孔菌子實體40 ℃烘干后粉碎,過60目篩,稱取50 g石油醚脫脂后的粉末,加入750 mL 95%乙醇,置于恒溫超聲提取機中400 W 50 ℃提取40 min。提取液抽濾后濃縮,-40 ℃冷凍凍干得到三萜粗提物。東方栓孔菌三萜粗提物三萜的質(zhì)量分數(shù)測定參考文獻[14]。

1.2.2 5種樹脂的靜態(tài)吸附-解吸特性試驗 稱取預處理后的5種大孔樹脂各1 g,置于三角瓶中,分別加入15 mL東方栓孔菌三萜粗提物溶液(三萜質(zhì)量濃度為2.627 g/L),在25 ℃下,110 r/min搖床中振蕩吸附24 h后過濾,測定濾液中的東方栓孔菌三萜質(zhì)量濃度,根據(jù)公式(1)和(2)計算各種樹脂對東方栓孔菌三萜的吸附量(mg/g)和吸附率(%)。

將吸附后的樹脂用蒸餾水洗至溶液無色,加入70%乙醇15 mL,振蕩解吸24 h,過濾后測定濾液的東方栓孔菌三萜質(zhì)量濃度,根據(jù)公式(3)和(4)計算各種樹脂對東方栓孔菌三萜的解吸量(mg/g)和解吸率(%)。

式(1);

式(2);

式(3);

式(4)。

式中:C0、C1和C2分別為三萜初始、平衡和洗脫液質(zhì)量濃度(g/L);V1和V2分別為提取液和洗脫液體積(mL);m為樹脂質(zhì)量(g)。

1.2.3 吸附等溫線制作 在25 ℃下,稱取已篩選出的大孔樹脂(X-5)14份,每份1 g,置于三角瓶中,加入15 mL質(zhì)量濃度分別為0、0.147、0.331、0.693、0.930、1.260、1.510、1.820、2.930、3.910、4.880、5.950、6.790、7.910 g/L東方栓孔菌三萜粗提物溶液,振蕩吸附24 h,至平衡。以平衡后溶液中的東方栓孔菌三萜質(zhì)量濃度為橫坐標,吸附量為縱坐標,制作東方栓孔菌三萜在X-5樹脂上的吸附等溫線。將所得吸附等溫線數(shù)據(jù)分別按照Langmuir和Freundlich吸附等溫方程進行非線性擬合。

式(5);

式(6)。

式中:Qe和Qm分別為平衡和飽和吸附量(mg/g);Ce為平衡質(zhì)量濃度(g/L);Kl和Kf分別為Langmuir和Freundlich平衡常數(shù);n為特征參數(shù)。

1.2.4 動態(tài)吸附與解吸

1.2.4.1 上樣質(zhì)量濃度對吸附穿透曲線的影響 稱取適量X-5樹脂,濕法裝柱(1.6 cm×30 cm)。在2 BV/h流速下,根據(jù)預實驗結果設置單因素上樣質(zhì)量濃度范圍。1.06、2.34和3.12 g/L東方栓孔菌三萜粗提物溶液依次過柱,每1 BV(1 BV表示1倍樹脂床體積,約60 cm3)收集1管流出液,測定流出液三萜質(zhì)量濃度,以上樣液體積為橫坐標,流出液三萜質(zhì)量濃度為縱坐標,繪制吸附穿透曲線。

1.2.4.2 上樣流速對吸附穿透曲線的影響 根據(jù)預實驗結果設置單因素上樣流速范圍。2.34 g/L東方栓孔菌三萜樣品液依次在1、2和3 BV/h流速下分別過柱,按1.2.4.1方法繪制吸附穿透曲線。

1.2.4.3 乙醇體積分數(shù)對解吸性能的影響 X-5樹脂對東方栓孔菌三萜的吸附達到飽和后,根據(jù)預實驗結果設置單因素乙醇體積分數(shù)范圍。在2 BV/h流速下,使用50%、70%和90%乙醇分別洗脫X-5樹脂,每1 BV收集1管洗脫液,測定洗脫液三萜質(zhì)量濃度,以洗脫液體積為橫坐標,洗脫液三萜質(zhì)量濃度為縱坐標,繪制洗脫曲線。根據(jù)公式(7)計算洗脫率。

式(7)

1.2.4.4 洗脫流速對解吸性能的影響 根據(jù)預實驗結果設置單因素洗脫流速范圍。東方栓孔菌三萜在X-5樹脂上飽和吸附后,選用70%乙醇作為解吸液,分別以1、2和3 BV/h流速洗脫X-5樹脂,按1.2.4.3方法繪制洗脫曲線。

1.2.5 三萜純度與純化倍數(shù)的測定 X-5樹脂純化后的三萜溶液經(jīng)濃縮、冷凍干燥得三萜粉末。根據(jù)公式(8)和(9)計算純度和純化倍數(shù)。

式(8);

式(9)。

1.2.6 動物分組與處理 小鼠適應性喂養(yǎng)1周,隨機分成6組,每組10只(雌雄各半)。東方栓孔菌三萜純化產(chǎn)物和水飛薊賓均用蒸餾水配制成懸液。陽性對照組小鼠灌胃150 mg/kg水飛薊賓,低、中、高試驗組分別灌胃100、200和400 mg/kg東方栓孔菌三萜,正常組和模型組灌胃蒸餾水,每天1次,連續(xù)20 d。之后正常組灌胃蒸餾水,其余組小鼠灌胃50%乙醇(12 mL/kg),每隔12 h一次,連續(xù)3次。

1.2.7 生化指標檢測 末次灌胃50%乙醇12 h后,小鼠眼眶采血,在4 ℃下,3000 r/min離心10 min,收集血清,按照試劑盒說明書測定血清中ALT和AST酶活;頸椎脫臼處死小鼠,取肝臟,加適量冷生理鹽水,制成10%(m/V)勻漿,按照試劑盒說明書測定肝組織中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件進行分析,結果采用平均值±標準差表示,顯著性分析采用Duncan法。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

如表2,X-5樹脂對東方栓孔菌三萜的靜態(tài)吸附率和解吸率均大于其它4種樹脂,因此選用X-5樹脂純化東方栓孔菌三萜。

表2 五種不同大孔樹脂對東方栓孔菌三萜的靜態(tài)吸附與解吸特性Table 2 Static adsorption and desorption performance of five different macroporous resins on triterpenes from Trametes orientalis

2.2 東方栓孔菌三萜在X-5樹脂上的吸附等溫線

在25 ℃下,東方栓孔菌三萜在X-5樹脂上的吸附等溫線如圖1所示。

圖1 X-5樹脂對東方栓孔菌三萜的吸附等溫線Fig.1 Adsorption isotherm of X-5 resin on triterpenes from Trametes orientalis

吸附等溫線用于描述恒溫下吸附劑的平衡吸附量與吸附液的平衡質(zhì)量濃度之間的關系。將圖1中的吸附等溫線分別按照Langmuir和Freundlich方程進行非線性擬合,得到兩方程的參數(shù)(表3)。對比兩方程的決定系數(shù),Langmuir方程能更好地描述東方栓孔菌三萜在X-5樹脂表面發(fā)生的吸附過程,亦說明X-5樹脂對東方栓孔菌三萜的吸附以單分子層吸附為主。

表3 X-5樹脂吸附東方栓孔菌三萜的Langmuir和Freundlich方程參數(shù)Table 3 Parameters correlated by Langmuir and Freundlich adsorption equations of X-5 resin on triterpenes from Trametes orientalis

2.3 動態(tài)吸附與解吸

2.3.1 上樣質(zhì)量濃度對吸附穿透曲線的影響 如圖2,當上樣三萜質(zhì)量濃度為1.06 g/L時,穿透點(流出液三萜質(zhì)量濃度為上樣三萜質(zhì)量濃度的1/10)時的上樣液體積為8 BV,此時三萜吸附量為274.9 mg/g,而X-5樹脂對三萜的吸附達到飽和時的上樣液體積為14 BV;當上樣質(zhì)量濃度為2.34 g/L時,穿透點為5 BV,此時三萜吸附量為413.8 mg/g,飽和吸附時的上樣液體積為10 BV;當上樣質(zhì)量濃度為3.12 g/L時,其穿透點出現(xiàn)在4 BV,此時三萜吸附量為431.5 mg/g,飽和吸附時為8 BV。由此可見,上樣質(zhì)量濃度越高,穿透點越靠前,穿透曲線越陡峭,達到飽和吸附的時間越短。質(zhì)量濃度上升至3.12 g/L時,穿透點處的三萜吸附量增幅不大;且溶液較渾濁,易對樹脂造成污染和堵塞。故較適宜的上樣質(zhì)量濃度為2.34 g/L。

圖2 不同上樣質(zhì)量濃度時X-5樹脂的吸附穿透曲線Fig.2 Breakthrough curves of X-5 resin at different loading concentrations

2.3.2 上樣流速對吸附穿透曲線的影響 不同上樣流速時,東方栓孔菌三萜經(jīng)X-5樹脂的吸附穿透曲線見圖3。上樣流速分別為1、2和3 BV/h時,東方栓孔菌三萜在X-5樹脂上的吸附穿透點分別為7、5和3 BV,穿透點時X-5樹脂對東方栓孔菌三萜的吸附量分別為582.9、414.6和229.6 mg/g,達到飽和吸附時的上樣液體積分別為15、10和7 BV。由此可知,穿透點處X-5樹脂對東方栓孔菌三萜的吸附量隨著上樣流速的提高而下降。上樣流速為1 BV/h時,穿透點時X-5樹脂對東方栓孔菌三萜的吸附量最大,但工作周期過長,效率低下;當上樣流速為2 BV/h時,穿透點時X-5樹脂對東方栓孔菌三萜的吸附量稍低,不過工作效率高于1 BV/h;當上樣流速為3 BV/h時,東方栓孔菌三萜上樣液還沒有被X-5樹脂完全吸附就流出,吸附效率低下。綜合考慮吸附量與工作效率,上樣流速為2 BV/h較適宜。

圖3 不同上樣流速時X-5樹脂的吸附穿透曲線Fig.3 Breakthrough curves of X-5 resin at different loading flow rates

2.3.3 乙醇體積分數(shù)對解吸性能的影響 不同乙醇體積分數(shù)時,東方栓孔菌三萜經(jīng)X-5樹脂的洗脫曲線見圖4。50%、70%和90%的乙醇所對應的東方栓孔菌三萜洗脫率分別為83.25%、91.19%和62.14%。X5樹脂所吸附的物質(zhì)為非極性,洗脫率應隨著乙醇體積分數(shù)的增加而增大,然而90%乙醇的洗脫率卻較低,可能由于隨著乙醇體積分數(shù)的提高會使一些醇溶性雜質(zhì)及脂溶性強的雜質(zhì)洗脫下來,而影響三萜的洗脫。使用70%乙醇洗脫時,洗脫率最高,故在解吸X-5樹脂上所吸附的東方栓孔菌三萜時,70%乙醇為較適宜的解吸液。

圖4 不同乙醇體積分數(shù)時X-5樹脂的洗脫曲線Fig.4 Elution curves of X-5 resin at different ethanol concentrations

2.3.4 洗脫流速對解吸性能的影響 由洗脫曲線(圖5)可知,洗脫流速為1、2和3 BV/h對應的洗脫率分別為84.55%、91.67%和65.71%。1 BV/h流速時,存在拖尾現(xiàn)象;3 BV/h流速時,洗脫率較低;2 BV/h流速時,洗脫率最高,且無拖尾現(xiàn)象。故在解吸X-5樹脂上所吸附的東方栓孔菌三萜時,洗脫流速宜控制在2 BV/h。

圖5 不同洗脫流速時X-5樹脂的洗脫曲線Fig.5 Elution curves of X-5 resin at different elution flow rates

2.3.5 三萜純度與純化倍數(shù)測定 在上述優(yōu)化的工藝條件下,采用X-5樹脂純化東方栓孔菌三萜粗提物,洗脫液濃縮、凍干后得到純化產(chǎn)物。粗提物與純化產(chǎn)物的純度分別為27.58%和83.30%,經(jīng)X-5樹脂純化后,三萜純度是純化前的3倍。

2.4 東方栓孔菌三萜對小鼠酒精性肝損傷的保護作用

2.4.1 東方栓孔菌三萜對血清ALT和AST含量的影響 東方栓孔菌三萜對酒精致肝損傷小鼠血清ALT和AST含量的影響見圖6。模型組小鼠血清ALT和AST含量均極顯著高于正常組(p<0.01),表明急性酒精攝入造成了小鼠肝細胞的損傷,這亦說明急性酒精性肝損傷小鼠造模成功。東方栓孔菌三萜低、中和高劑量組小鼠血清ALT含量均極顯著低于模型組(p<0.01),三萜劑量越高,兩種轉氨酶含量下降的程度亦越高。陽性對照組小鼠血清ALT和AST含量亦極顯著低于模型組(p<0.01)。

圖6 東方栓孔菌三萜對酒精致肝損傷小鼠血清ALT和AST含量的影響Fig.6 Effects of triterpenes from Trametes orientalison serum ALT and AST levelsin alcohol-treated mice with liver injury注:##與正常組相比,差異極顯著(p<0.01);**與模型組相比,差異極顯著(p<0.01);n=10,表4同。

血清ALT和AST含量升高是肝細胞損傷的敏感指標,乙醇代謝過程中產(chǎn)生的活性氧可損害生物膜,導致血清ALT和AST升高[17]。低、中和高劑量東方栓孔菌三萜均能顯著拮抗酒精誘導的小鼠血清ALT和AST含量升高,表明東方栓孔菌三萜對酒精致小鼠急性肝損傷具有較好保護作用。

2.4.2 東方栓孔菌三萜對肝組織中抗氧化酶和MDA含量的影響 表4為東方栓孔菌三萜對酒精致急性肝損傷小鼠的肝組織SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量的影響。模型組小鼠肝臟SOD、CAT、GSH-Px活性均極顯著低于正常組(p<0.01),MDA含量極顯著高于正常組(p<0.01),表明急性酒精攝入造成了小鼠肝臟抗氧化防御系統(tǒng)的損傷,亦進一步說明急性酒精性肝損傷小鼠造模成功。東方栓孔菌三萜低、中、高劑量組小鼠肝臟中SOD、CAT、GSH-Px活性均極顯著高于模型組(p<0.01),MDA含量極顯著低于模型組(p<0.01)。三萜劑量越高,抗氧化酶上升與MDA下降的程度亦越高。陽性對照亦能極顯著提高抗氧化酶活性(p<0.01),降低MDA含量(p<0.01)。

表4 東方栓孔菌三萜對酒精致肝損傷小鼠肝臟SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量的影響Table 4 Effects of triterpenes from Trametes orientalis on liver SOD,CAT,GSH-PX activities and MDA levels in alcohol-treated mice with liver injury

SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶是機體抗氧化防御體系的重要組成部分[18];MDA則是脂質(zhì)過氧化的主要終產(chǎn)物,可造成機體進一步損傷,MDA含量可反映機體氧化損傷的程度[19-20]。東方栓孔菌三萜能顯著提高酒精誘導的小鼠肝臟SOD、CAT和GSH-Px活性,降低MDA含量,表明東方栓孔菌三萜可提高機體抗氧化能力,減少脂質(zhì)過氧化的發(fā)生。結合東方栓孔菌三萜的體外抗氧化活性[11],可初步認為東方栓孔菌三萜可能是通過提高體內(nèi)抗氧化酶活性、直接清除自由基和螯合金屬離子等途徑發(fā)揮其對急性酒精性肝損傷的保護作用。這與前人研究結果較一致,很多其它來源的三萜類物質(zhì)也是通過抗氧化途徑發(fā)揮其對實驗性肝損傷的保護作用[21-23]。

3 結論

所選5種供試大孔樹脂中,X-5樹脂對東方栓孔菌三萜具有較好的靜態(tài)吸附與解吸性能,東方栓孔菌三萜在X-5樹脂表面的吸附符合Langmuir模型,以單分子層吸附為主。動態(tài)吸附時,選擇2.34 g/L三萜溶液,在2 BV/h流速下上樣較為適宜;動態(tài)解吸時,選擇70%乙醇,在2 BV/h流速下洗脫較為適宜。經(jīng)X-5樹脂純化后,東方栓孔菌三萜純度為83.30%,是純化前的3倍,表明X-5樹脂純化東方栓孔菌三萜效果較佳。

東方栓孔菌三萜能極顯著緩解酒精誘導的小鼠血清ALT和AST含量的升高(p<0.01),極顯著拮抗酒精所致小鼠肝臟SOD、CAT和GSH-Px活性的下降(p<0.01),極顯著降低MDA的生成(p<0.01),表明東方栓孔菌三萜對酒精致小鼠急性肝損傷具有較好保護作用。