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(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524008;2.廣東省亞熱帶果蔬加工科技創(chuàng)新中心,廣東湛江 524008;3.廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(熱帶特色園藝)產(chǎn)業(yè)技術研發(fā)中心,廣東湛江 524008)

菠蘿蜜(ArtocarpusheterophyllusLam.)又稱木菠蘿,在中國種植已有1000多年的歷史,主要集中在海南、廣東、廣西、云南、福建和四川南部等熱帶、亞熱帶地區(qū)[1]。菠蘿蜜的果實柔軟可口,香氣撲鼻,是熱帶的一種珍貴藥材。菠蘿蜜的整果含有含有豐富的糖類、蛋白質(zhì)、B族維生素、維生素C、礦物質(zhì)、脂肪油等,菠蘿蜜釀造的果酒能夠更好地保存菠蘿蜜原有的風味和各種營養(yǎng)成分[2],但是相比其他水果,關于菠蘿蜜果酒發(fā)酵的研究較少。

王大陸等[3]對菠蘿蜜果酒釀造工藝進行了研究,得出了菠蘿蜜果酒最佳工藝條件。張玲等[2]對菠蘿蜜果酒加工工藝做了進一步研究,在接種量為5%,發(fā)酵前糖度20%,酸度為4.5,于28 ℃發(fā)酵9 d,得到的菠蘿蜜果酒整體質(zhì)量最好,并對果酒的澄清工藝進行了研究,優(yōu)化了菠蘿蜜果酒生產(chǎn)工藝,最終制得的菠蘿蜜果酒具有良好的穩(wěn)定性,屬于半甜型低度酒,酒體色澤金黃,口感柔和。關紅艷[4]研究得出了發(fā)酵菠蘿蜜果酒口感最佳的條件。研究者使用的果酒酵母都是市售的酵母,而沒有篩選出菠蘿蜜果酒專用酵母。目前,菠蘿蜜果酒研究基本上停留在實驗室階段,缺乏菠蘿蜜果酒專用酵母。

因此,本文以菠蘿蜜為原料進行自然發(fā)酵,培養(yǎng)出大量菌株,再經(jīng)過逐級篩選出適合菠蘿蜜果漿發(fā)酵的菌種,并對其多方面性能進行測試,以期篩選出菠蘿蜜果酒的專用釀造酵母,解決菠蘿蜜果酒發(fā)酵過程中酵母菌產(chǎn)率低、難保存、易變異等問題,提高菠蘿蜜果酒發(fā)酵過程中酵母菌的產(chǎn)酒率,并使該種酵母能夠連續(xù)穩(wěn)定的發(fā)酵菠蘿蜜果漿,從而為菠蘿蜜果酒的工業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿蜜 購于廣東湛江種植農(nóng)地;硝酸鉀、硫酸銨、氫氧化鈉、NaCl、檸檬酸、可溶性淀粉、無水乙醇、蔗糖、乳糖、果膠酶(酶活力10000 UPTE/mL) 泰州聚豐源生物科技有限公司;富集培養(yǎng)基(麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基):麥芽浸粉加入4倍水后60 ℃保溫糖化,用碘液檢驗至糖結束,用蔗糖調(diào)糖至10 °Bx,分裝,121 ℃,20 min;菠蘿蜜發(fā)酵培養(yǎng)基(菠蘿蜜果漿):菠蘿蜜榨汁(添加二氧化硫80 mg/L,果膠酶處理100 mg/L),于115 ℃滅菌15 min。

BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;WYT-4手持糖度計 鄭州南北儀器設備有限公司;HR7625打漿機 PHLIPS;XSP-2CA生物顯微鏡 上海光學儀器廠;GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風干燥箱 上海右一儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌富集培養(yǎng)和分離純化 選擇成熟干凈的菠蘿蜜果肉打漿,添加二氧化硫100 mg/L,果膠酶100 mg/L 30 ℃處理3 h,用蔗糖調(diào)糖度為21 °Brix,自然pH。在500 mL無菌三角瓶中添加打漿液300 mL,28 ℃發(fā)酵直到無氣泡產(chǎn)生[5]。取10 mL菠蘿蜜果漿自然發(fā)酵液用無菌水稀釋至10-1,再逐步稀釋到10-6,并在每組中進行三次平行試驗。振蕩5 min后,吸取0.1 mL上清液涂布麥芽汁瓊脂固體培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫48 h。待菌株長出菌落后,挑取表面光滑奶油狀,有酒香的單菌落劃線分離2～3次[5],最后將單個典型菌落移植于YPD培養(yǎng)基中保存。

1.2.2 酵母菌一級篩選 采用TTC法[8]。在YPD固體培養(yǎng)基中接入分離的各菌株,24 h在長出的菌落上覆蓋一層含0.5%TTC顯色劑的YPD固體培養(yǎng)基,形成雙層培養(yǎng)基。酒精濃度不一的酵母菌落會顯示各種顏色,深紅色是高濃度酒精的菌落[6],從中挑選具有良好性狀和深色的酵母菌株,并且重復試驗三次。

1.2.3 酵母菌二級篩選 選采用杜氏管發(fā)酵法,在含有杜氏小管的YPD培養(yǎng)液中接入一級篩選的菌株,分別在24、48 h錄杜氏管中出現(xiàn)氣體的情況。重復三次。根據(jù)產(chǎn)氣時間和產(chǎn)氣量的多少篩選出耐高溫和發(fā)酵性能好、起酵快的酵母菌株。

1.2.4 酵母菌三級篩選 在菠蘿蜜果漿中接入菌種,28 ℃培養(yǎng)7 d[8],拆開封口膜,輕輕晃動錐形瓶,對發(fā)酵液的氣味進行感官評定。篩選出有產(chǎn)酒香味并伴有菠蘿蜜特征香味能力的酵母菌,再進一步進行感官評定。最后得到發(fā)酵性能良好的菠蘿蜜果酒酵母。

1.2.5 酵母菌鑒定

1.2.5.1 細胞形態(tài)學鑒定 對最后得到的菌株在顯微鏡下進行細胞形態(tài)的觀察。

1.2.5.2 生理生化試驗 發(fā)酵糖類試驗、同化碳源試驗同化氮源試驗、其他生理生化試驗(無維培養(yǎng)、高滲培養(yǎng)、0.01放線菌酮培養(yǎng))[9]。

1.2.5.3 篩選菌株的26S rDNA序列分子生物學鑒定 本實驗采用通用引物26S rDNA[9],其PCR擴增:94 ℃預變性4 min,94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共30個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。由上海生工生物公司測序,并運用Blast程序與數(shù)據(jù)庫中已存在的真菌26S rDNA核苷酸序列進行相似性比較分析,選取其中同源性較高的菌株,用MEGA 軟件計算序列相似性并進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析,構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 性能試驗

1.2.6.1 溫度耐受性試驗 取菠蘿蜜果漿調(diào)節(jié)糖度為21 °Brix,接種量為7%,將待發(fā)酵液分別放置在25、28、31、34、37、40 ℃溫度下發(fā)酵,培養(yǎng)7 d后用蒸餾法[10]測分別其酒精度。

1.2.6.2 pH耐受性試驗 分別用檸檬酸和氫氧化鈉溶液將菠蘿蜜汁的pH調(diào)節(jié)至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5,糖度為21 °Brix,接種量為7%,于28 ℃條件下培養(yǎng)7 d,用蒸餾法測發(fā)酵液酒度[10]。

1.2.6.3 初始糖度耐受性試驗 用白糖將菠蘿蜜果漿糖度調(diào)整為17、21、25、29、33 °Brix,接種量為7%,于28 ℃條件下培養(yǎng)7 d,用蒸餾法測其酒精度。

1.2.6.4 SO2耐受性試驗 在菠蘿蜜汁培養(yǎng)液中分別添加亞硫酸鈉80、100、120、140、160 mg/L,糖度為21 °Brix,7%的接種量在 28 ℃的條件下培養(yǎng)7 d,用蒸餾法測發(fā)酵酒度。

1.2.6.5 酒精度耐受性試驗 用2%的蔗糖水活化酵母,分別取200 μL加入酒精含量為1%、3%、5%、7%、9%、11%的15 mL的帶杜氏管液體培養(yǎng)基,搖勻,分別測定初始吸光度值,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,在560 nm紫外光下測定吸光度,48 h再次測定吸光度。

1.2.6.6 酵母菌傳代穩(wěn)定性測定 將酵母菌傳8代,將1～8代的酵母菌接入菠蘿蜜果漿,接種量為7%,28 ℃的條件下培養(yǎng)7 d用蒸餾法測其酒精度,觀察菌株傳代穩(wěn)定性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010工作表進行數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 酵母菌分離純化結果

根據(jù)酵母菌的菌落特征及顯微鏡形態(tài)特征[11],分離出90株酵母菌,結果如表1所示。分離的酵母菌觀察到菌落的顏色大部分是白色或乳白色,中間的顏色與邊緣的顏色相同,有的散發(fā)出愉悅的酒香味。在顯微鏡下觀察到的酵母菌有正圓形、橢圓形、短桿狀等;繁殖方式為一端出芽。將分離出的90株酵母菌根據(jù)菌落形態(tài)命名為A1～A36、B1～B27、C1～C27。

表1 酵母菌分離結果Table 1 Results of yeast isolation

2.2 酵母菌一級篩選結果

一級篩選結果如表2所示。由表2可以看出,經(jīng)過24 h培養(yǎng)和3 h顯色劑顯色后,有12株酵母菌呈紅色,有48株酵母菌呈深紅色。下一步將使用這60株產(chǎn)酒能力較強的酵母菌進行二次篩選。

表2 TTC顯色法篩選結果Table 2 The results of TTC color demonstration test

2.3 酵母菌二級篩選結果

二級篩選結果如表3所示。結果顯示,培養(yǎng)48 h后有30株酵母菌產(chǎn)生氣體,其中產(chǎn)氣充滿杜氏管體積的有13株。產(chǎn)氣情況為“++”和“+++”的25株酵母菌的試管不時出現(xiàn)氣泡,底部均有沉淀,說明這些酵母菌的生長和發(fā)酵速率較強。下一步將對這25株菌進行三級篩選。

表3 杜氏管法篩選結果Table 3 The results of durham ture test

2.4 酵母菌三級篩選結果

在菠蘿蜜果漿中接種活化的25株酵母菌,發(fā)酵7 d后進行感官評定篩選。其篩選結果如表4所示。

表4 發(fā)酵液感官評價結果Table 4 Sensory evaluation of zymotic fluid

在25瓶發(fā)酵液中,有的散發(fā)出酒味和菠蘿蜜特殊香味,也有的出現(xiàn)酸臭味等不良氣味。對篩選出的9株有產(chǎn)酒香味并伴有菠蘿蜜特征香味能力的酵母菌再進一步感官評定,篩選結果如表5所示。

表5 發(fā)酵液感官排名結果Table 5 Sensory evaluation of zymotic fluid

C20發(fā)酵液的酒香味最高,A21排第二。而A21的菠蘿蜜特征香味最強,是典型的菠蘿蜜香味。結合發(fā)酵液的酒香、菠蘿蜜特征香氣,選定編號A21的酵母菌為最佳菌株。

2.5 酵母菌鑒定結果

2.5.1 菌落形態(tài)與細菌形態(tài)鑒定結果 由圖1酵母菌A21的菌落形態(tài)可以看出,酵母菌A21在培養(yǎng)基上的菌落為凸起奶油狀,表面光澤,菌落邊緣圓整。酵母菌A21在鏡檢下的個體形態(tài)如圖2所示,酵母菌A21的營養(yǎng)細胞是正圓形,繁殖方式為一端出芽。

圖1 酵母菌的菌落形態(tài)圖Fig.1 The colonial morphology of yeast

圖2 顯微鏡下細胞形態(tài)圖(100×)Fig.2 Cells morphous of the yeast under microscope(100×)

2.5.2 生理生化試驗結果 由表6可以看出,A21菌株能將D-葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、菊糖、棉籽糖、海藻糖、D-甘露醇、L-鼠李糖等碳源同化;不能同化赤蘚糖醇、L-阿拉伯糖、檸檬酸鹽、纖維二糖、木糖醇、D-核糖、琥珀酸等碳源。同化氮源試驗結果表明,該株菌株不能同化L-賴氨酸、硝酸鉀、尸胺等氮源。同時其他生理生化試驗結果表明,該株菌株能夠能生長在無維生素培養(yǎng)基上;能夠在30、35、40 ℃下生長;能夠在50% D-葡萄糖和60% D-葡萄糖中生長;不能在0.01%的放線菌酮中生長。

表6 酵母菌A21生理生化試驗結果Table 6 Results of physiology and biochemistry test of yeast A21

根據(jù)菌落特征和細胞形態(tài)學的觀察結果,以及發(fā)酵糖、同化碳源、同化氮源、無維生素生長、高溫生長、高濃度D-葡萄糖生長、抗放線菌酮等生理生化試驗的結果,對照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[9],可以確定A21為酵母屬的釀酒酵母。

2.5.3 分子生物學鑒定結果 如圖3構建了包括A21菌株及相關菌種在內(nèi)的26S rDNA序列系統(tǒng)進化樹。Saccharomycesmikatae[12]、Saccharomycesparadoxus[13]、Saccharomyceskudriavzevii[12]是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的3個種。菌株A21與釀酒酵母(S.cerevisiae)的遺傳距離最近,二者相似性為100%。據(jù)此再進一步確定最后篩選的酵母菌株A21屬于酵母屬(Saccharomyces)的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

圖3 菌株A21的進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of the yeast A21

2.6 性能試驗結果

2.6.1 溫度耐受性試驗 由圖4可得,酵母菌在25～40 ℃的選定范圍內(nèi),發(fā)酵酒精度先升高,31 ℃后又逐漸下降。由于低溫抑制酶的活性,影響細胞的代謝活性并抑制酵母的繁殖,因此,在溫度低于28 ℃酒精的產(chǎn)率較低。而超過31 ℃時,某些酶活性降低甚至失去活性,導致酵母菌的發(fā)酵能力降低。因此此酵母最佳的生長溫度為28～31 ℃。

圖4 酵母菌溫度耐受性試驗結果Fig.4 Results of temperature resistance on yeast

2.6.2 pH對酵母菌的影響 由圖5可以看出,在pH為4.5～5.5時,隨著pH的升高,該酵母菌產(chǎn)酒精能力逐漸增強,在pH為5.5時,產(chǎn)酒精能力最強,在pH大于5.5時,酵母菌產(chǎn)酒精能力逐漸減弱。由此可見,該酵母菌在較低的pH條件下,酵母菌會發(fā)生應急反應,使細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧,而這些活性氧氣會攻擊細胞中的膜脂、DNA等物質(zhì),損傷細胞[14]。因此此酵母最佳發(fā)酵pH為5.5。

圖5 酵母菌pH耐受性試驗結果Fig.5 Results of pH resistance on yeast

2.6.3 初始糖度對酵母菌的影響 從圖6中得出,在初始糖含量為17～29 °Brix時,該酵母菌產(chǎn)酒能力隨著糖度的增加而提高,在初始糖度為29 °Brix時,產(chǎn)酒精能力最高。當初始糖度大于29 °Brix時,外部環(huán)境的滲透壓也隨之增加,從而抑制酵母菌細胞代謝酶的活性,所以產(chǎn)酒能力開始下降。因此此酵母最佳發(fā)酵初始糖度為29 °Brix。

圖6 酵母菌初始糖度耐受性試驗結果Fig.6 Results of initial brix tolerance test on yeast

2.6.4 二氧化硫耐受性 添加SO2不僅能抑菌殺菌,還能抗氧化和澄清果汁。由圖7得出,當SO2濃度小于80 mg/L時,發(fā)酵酒精度隨SO2濃度的升高而升高,當SO2濃度為80 mg/L時,該酵母菌酒產(chǎn)酒精能力最高,當SO2濃度大于80 mg/L時,隨著SO2濃度的增加而逐漸降低。因此最適SO2添加量為80 mg/L。

圖7 酵母菌SO2耐受性試驗結果Fig.7 Results of sulfur dioxide tolerance on yeast

2.6.5 酒精度耐受性 從圖8可以看出,同一初始酒精度的酵母菌隨著時間的增長,酵母菌吸光度均增大,說明酵母菌在生長繁殖,培養(yǎng)基中酵母菌濃度增大。對于不同的初始酒精濃度,隨著初始酒精含量的增加,在600 nm可見光下的吸光度值隨著時間的增加幅度下降,說明初始酒精度對酵母菌的生長產(chǎn)生了抑制。在初始酒精度達到7%的時候,酵母菌48 h吸光度增加量明顯下降,此時酵母菌的生長被抑制,在初始酒精度為11%時,酵母菌吸光度增長很小,已接近酵母菌酒精度耐受性極限。

圖8 酵母菌酒精度耐受性Fig.8 Alcohol tolerance of yeast A21

2.6.6 酵母菌傳代穩(wěn)定性測定 圖9表明,同一條件每代發(fā)酵的酒精度接近一致,酵母菌A21的傳代穩(wěn)定性良好,產(chǎn)酒精能力穩(wěn)定,可用來作為后續(xù)的改良馴化及菠蘿蜜果酒發(fā)酵菌種。

圖9 酵母菌A21傳代穩(wěn)定性Fig.9 Passage stability of yeast A21

3 結論

本文以菠蘿蜜為發(fā)酵原料,通過富集培養(yǎng)和分離純化,經(jīng)過三級篩選得到一株適用于菠蘿蜜果酒發(fā)酵的酵母菌A21。通過形態(tài)學,生理生化鑒定初步判斷A21為酵母,最后結合分子學鑒定為釀酒酵母。對A21為酵母菌的性能測試結果表明,該酵母菌在25～35 ℃能正常生長,最適發(fā)酵溫度為28～31 ℃,初始糖度為29 °Brix時,產(chǎn)酒精能力最高。在pH5.5時,產(chǎn)酒精能力最強。當SO2添加量為80 mg/L時,產(chǎn)酒精能力達到最高。當初始酒精度為7%時,能抑制該酵母菌的生長,初始酒精度為11%時,接近酵母菌酒精度耐受性的極限。該酵母菌的傳代穩(wěn)定性良好,產(chǎn)酒精能力穩(wěn)定,產(chǎn)酒精度穩(wěn)定在10°左右,可用作改良馴化及菠蘿蜜果酒發(fā)酵菌種。