李阜爍，汪超，林文珍，范夢(mèng)珠，Yacine Hemar，洪志駿，陳平，張少輝,

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240；2.浙江熊貓乳業(yè)集團(tuán)股份有限公司，浙江溫州325800；3.浙江輝肽生命健康科技有限公司,浙江溫州325800）

0 引 言

隨著生活水平的提高，人們對(duì)飲食的要求從“追求量”轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)“質(zhì)”的追求。因此對(duì)具有特殊功能的生物活性肽的研究成為熱點(diǎn)。生物活性肽主要是由2～20個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)片段[1]?，F(xiàn)已從食物中發(fā)現(xiàn)了很多不同種類的生物活性肽，例如從發(fā)酵乳[2-3]、大豆[4]、花生[5]以及動(dòng)物皮膚[6]發(fā)現(xiàn)了很多具有生物活性的多肽，而且實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可能具有抗氧化、抗菌、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、降血壓等功能。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體抵御外界有害物質(zhì)入侵的第二道防線，廣泛存在于機(jī)體各種組織中，是主要免疫應(yīng)答細(xì)胞，通過(guò)吞噬及分泌細(xì)胞因子參與免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用[7]。對(duì)于巨噬細(xì)胞的研究有很多，但是針對(duì)巨噬細(xì)胞中存在的多肽的研究甚少。因此，在巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫功能時(shí)，是否有多肽參與并發(fā)揮作用是一個(gè)值得探究的課題。

本課題以小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，研究巨噬細(xì)胞內(nèi)的多肽，建立巨噬細(xì)胞多肽數(shù)據(jù)庫(kù)，為后續(xù)研究巨噬細(xì)胞中多肽具有的生物活性和作用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與設(shè)備

材料:Balb/c小鼠（SPF級(jí)，雄性6～8周齡），10 ku超濾管，40μm細(xì)胞篩網(wǎng)，Corning 10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，Ziptip C18柱。

試劑：DMEM完全培養(yǎng)液（青霉素100 U/mL、鏈霉素100μg/mL和10%胎牛血清），M-CSF，磷酸鹽緩沖液（PBS），EDTA，紅細(xì)胞裂解液，PE標(biāo)記的抗小鼠F4/80抗體，APC標(biāo)記的抗小鼠CD11b抗體，脂多糖（LPS），二硫蘇糖醇（DTT），碘乙酰胺（IAA），乙腈，甲酸。

設(shè)備：BJ-2CD超凈工作臺(tái)，GL-22M高速冷凍離心機(jī)，BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀，手術(shù)剪，超聲波破碎儀，細(xì)胞培養(yǎng)箱，離心濃縮干燥儀，納升液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，電熱恒溫水浴鍋。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓巨噬細(xì)胞的獲取

依據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有關(guān)規(guī)定，采用快速脊椎脫臼法處死小鼠，用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精浸泡5 min，對(duì)小鼠進(jìn)行體表消毒殺菌。將小鼠移置已經(jīng)紫外線殺菌的超凈臺(tái)中，用消毒后的手術(shù)剪將兩側(cè)大腿取下，剝離皮膚和肌肉組織，得到干凈的股骨和脛骨置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中。用無(wú)菌手術(shù)剪剪開(kāi)股骨上下兩側(cè)，用冷PBS將骨髓沖出，直到骨髓腔發(fā)白為止。骨髓沖洗懸液過(guò)40μm細(xì)胞篩網(wǎng)，使組織分散成單個(gè)細(xì)胞，對(duì)懸液進(jìn)行離心，離心條件為4℃，400 g，5 min。棄去上清液，向離心管中加入適量紅細(xì)胞裂解液，用槍頭吹打均勻，再混勻后，室溫放置1 min，迅速加入10倍量的PBS中和，在4℃，400 g條件下離心5 min，棄上清。

用DMEM完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞均勻接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入M-CSF使其終質(zhì)量濃度為50 ng/mL，在37℃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的CO2，95%濕度條件下培養(yǎng)3 d后更換新鮮培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)至7 d后，得到分化完全的小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞[8-9]。

1.2.2 流式分析骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞純度

棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用PBS洗滌貼壁細(xì)胞，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的EDTA溶液，37℃下放置15 min，鏡下觀察消化狀態(tài)。待消化完全加入等體積完全培養(yǎng)液，終止消化，收集細(xì)胞于15 mL離心管中，再以4℃（400 g）5 min的條件進(jìn)行離心，棄去上清液，用完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。加入PE標(biāo)記的抗小鼠F4/80抗體，APC標(biāo)記的抗小鼠CD11b抗體，在4℃下孵育30 min，避光，用流式細(xì)胞儀鑒定所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞成功比例[10]。

1.2.3 構(gòu)建炎癥細(xì)胞

誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，換細(xì)胞培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加質(zhì)量濃度為100 ng/mL LPS刺激，對(duì)照組加等量的PBS液。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的EDTA溶液消化，收集細(xì)胞于離心管中并計(jì)數(shù)。

1.2.4 胞內(nèi)多肽樣品的分離

將離心管中細(xì)胞（約107個(gè)）在4℃（1530 g）5 min的條件下進(jìn)行離心，離心后棄上清，收集的細(xì)胞用4℃冷卻的PBS洗滌兩次，加入400μL的PBS溶液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液放在冰盒上進(jìn)行超聲破碎，超聲破碎功率為40 W，破碎時(shí)間10 min，超聲時(shí)間3 S，間隔5 S。將破碎后的混合液進(jìn)行低溫離心，離心條件為4℃（13 700 g）15 min。離心后取上清，加入濃度為1 mol/L的DTT至終濃度為50 mmol/L，在56℃的恒溫水浴鍋中保溫30 min。向上清中加入40μL濃度為1 mol/L的IAA溶液，室溫避光反應(yīng)20 min。在4℃（13 700 g）15 min條件下進(jìn)行離心分離，收集上清液，即為胞內(nèi)多肽提取液。保存在-20℃條件下備用。

將獲得的胞內(nèi)多肽提取液用10 ku超濾管進(jìn)行超濾，超濾條件4℃（13 700 g）1 h。收集超濾液，濾液用離心濃縮干燥機(jī)進(jìn)行干燥，干燥后的樣品經(jīng)Ziptip C18脫鹽處理，備用。

1.2.5 納升液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析

溶液配制：（1）溶解緩沖液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液；（2）洗滌緩沖液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液；（3）洗脫緩沖液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%乙腈0.1%甲酸溶液；（4）上樣緩沖液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%乙腈和0.1%甲酸溶液。配制過(guò)程中所用水均是超純水。

Ziptip分別用100%乙腈和0.1%甲酸水平衡，將干燥后的固體樣品溶于20μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸水溶液中，振蕩10 min，用平衡后的Ziptip反復(fù)吸打樣品，用100μL 0.1%甲酸洗滌后，用20μL含20%乙腈、0.1%甲酸洗脫緩沖液洗脫樣品，洗脫后的樣品用離心濃縮干燥儀干燥，50～55℃、10 min。干燥后的樣品加入30μL上樣緩沖液溶解，溶解后的樣品進(jìn)行離心，條件為15 650 g、10 min、室溫。取上清液加入樣品瓶進(jìn)行LC-MS分析，為防止儀器誤差，每個(gè)樣品做三次質(zhì)譜分析。

HPLC-MS條件及過(guò)程：樣品分析是由Nano LC-QTOFMS/MS（納升液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用）系統(tǒng)完成，它的最大操作壓力為68.95 MPa，分辨率大于20 000，使用的多肽富集柱為C18反相柱(75 mm×2 cm×3μm)，液相色譜分析柱為C18反相分析柱(75 mm×15 cm×3μm)。樣品進(jìn)樣量為1 μL，流動(dòng)相A是0.1%甲酸水混合液，流動(dòng)相B為乙腈（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸）。流動(dòng)相流速為250 nL/min，流動(dòng)相梯度變化如下：在10 min內(nèi)的起始梯度為2%的流動(dòng)相B；110 min內(nèi)流動(dòng)相B上升到20%；到125 min時(shí)，流動(dòng)相B上升到30%；60 s內(nèi)上升到80%的流動(dòng)相B，并維持10 min；再下降至2%的流動(dòng)相B并維持15 min，最后系統(tǒng)用100%流動(dòng)相A平衡15 min。質(zhì)譜分析時(shí)采用ESI+模式，質(zhì)譜電噴霧毛細(xì)管電壓設(shè)置為2 000 V，氣體流速設(shè)為2.0 L/min，離子源溫度為150℃，選擇電荷數(shù)+1，+2，+3和+4的母離子且質(zhì)核比為100～1 500 u的進(jìn)行二級(jí)碎裂，采用數(shù)據(jù)依賴性采集（DDA）模式進(jìn)行掃描。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以UniProt(http://www.uniprot.org/)中小鼠的數(shù)據(jù)作為現(xiàn)有蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索比對(duì)。檢測(cè)結(jié)果使用Data Analysis4.1軟件提取離子峰生成mgf文件，小鼠多肽序列通過(guò)Mascot 2.4搜索引擎搜索匹配以上蛋白氨基酸數(shù)據(jù)庫(kù)得到。

檢測(cè)過(guò)程中設(shè)置的條件：母離子質(zhì)量容差為2.5×10-5；二級(jí)譜圖質(zhì)量容差為0.050 u，固定修飾為Carbamidomethyl（C），可變修飾為Oxidation（M）。多肽選擇的分?jǐn)?shù)＞15，p值設(shè)置為p＜0.05，一個(gè)蛋白至少檢出一條肽段。

2 結(jié)果與討論

2.1 流式分析巨噬細(xì)胞純度

獲取小鼠骨髓細(xì)胞并用M-CSF誘導(dǎo)后，于第7天用流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞的情況。結(jié)果顯示F4/80和CD11b陽(yáng)性，并且巨噬細(xì)胞純度達(dá)到98%以上，結(jié)果如圖1所示。因此認(rèn)為小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)成功。

圖1 流式檢測(cè)7d后小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞純度

2.2 NanoLC/Q-TOFMS/MS分析結(jié)果

以UniProt（http://www.uniprot.org/）中小鼠蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)作為多肽檢索數(shù)據(jù)庫(kù)，用Mascot 2.4搜索引擎檢索以上蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，人工篩選p＜0.05的所有和母體蛋白序列相配對(duì)的多肽片段，并在三次質(zhì)譜中最少出現(xiàn)兩次的多肽序列，以此確定分離得到的多肽。數(shù)據(jù)通過(guò)DataAnalysis分析，三次質(zhì)譜分析結(jié)果如圖2所示。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析質(zhì)譜結(jié)果，在本次研究中共鑒定得到340條多肽,實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)得到的多肽有242條，來(lái)源于80條前體蛋白；對(duì)照組有255條,來(lái)源于92條前體蛋白（多肽數(shù)量如下圖3所示）。發(fā)現(xiàn)其中部分多肽序列在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中共同存在，數(shù)量為157條，從種類和數(shù)量上可以看出，巨噬細(xì)胞內(nèi)多肽種類比較復(fù)雜。

在經(jīng)過(guò)LPS刺激后，與對(duì)照組相比巨噬細(xì)胞內(nèi)新增85條多肽，這些新增的多肽可能在巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，其中157條是巨噬細(xì)胞受到刺激前后均存在的胞內(nèi)多肽。Gelman[11]等人在對(duì)人類細(xì)胞系SY5Y，MCF7和HEK293進(jìn)行多肽組學(xué)分析時(shí)，在三種細(xì)胞內(nèi)分別檢測(cè)到多肽102條、110條和219條，其中有114條多肽至少在兩種細(xì)胞中同時(shí)存在。這不僅說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)多肽的復(fù)雜性，也反映出不同細(xì)胞內(nèi)會(huì)有相同的多肽存在，這一結(jié)果與本研究中出現(xiàn)的結(jié)果一致。

圖2 小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞胞內(nèi)多肽的Nano LC–MS/MS質(zhì)譜圖

圖3 檢測(cè)到的BMDM中所有多肽維恩

本研究中得到的多肽大多來(lái)自波形蛋白、半乳糖凝集素1、組織蛋白酶B，因?yàn)槎嚯膶儆诘鞍椎囊徊糠?，蛋白發(fā)揮功能時(shí)和組成蛋白的多肽片段有很大的關(guān)系，因此從蛋白功能的角度猜測(cè)可能多肽可能的生物活性。波形蛋白是一種中間絲蛋白，主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等中胚層起源的間充質(zhì)細(xì)胞中。波形蛋白具有維持細(xì)胞的正常形態(tài)的功能,并且參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移和細(xì)胞免疫等過(guò)程[12]。半乳糖凝集素1可通過(guò)調(diào)節(jié)參與固有和適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子（例如FcγRI和MHC-II）的表達(dá)和功能對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行一定的調(diào)節(jié)作用，也可以通過(guò)ERK1/2依賴性途徑調(diào)節(jié)單核細(xì)胞活性，但不會(huì)影響人單核細(xì)胞的存活[13]。組織蛋白酶B參與細(xì)胞凋亡過(guò)程，當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)（如炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等），溶酶體膜通透性增大，甚至破裂，大量組織蛋白酶B釋放到細(xì)胞漿或細(xì)胞間隙中，可能激活細(xì)胞凋亡信號(hào)，造成細(xì)胞凋亡[14]。蛋白質(zhì)是由氨基酸以“脫水縮合”的方式組成多肽鏈，再由多肽鏈經(jīng)過(guò)盤(pán)曲折疊形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，因此蛋白質(zhì)發(fā)揮其生理功能與氨基酸組成密切相關(guān)，通過(guò)前體蛋白的功能來(lái)預(yù)測(cè)其多肽可能具有的活性。這3條蛋白都在細(xì)胞免疫過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，因此來(lái)自于這些蛋白的多肽可能存在免疫調(diào)節(jié)功能。

將得到的多肽序列通過(guò)谷歌（https://www.google.com.hk/)、歐洲專利局（http://www.epo.org/）、專利檢索及分析（http://www.pss-system.gov.cn/sipopublicsearch/portal/uiIndex.shtml和PCT(http://www.wipo.int/pct/en/)等網(wǎng)址進(jìn)行搜索比對(duì)，確定被報(bào)道和未被報(bào)道的多肽。未被報(bào)道的多肽即為本課題新發(fā)現(xiàn)的多肽，結(jié)果如圖4所示。最終發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的242條多肽中有61條為新發(fā)現(xiàn)的肽，有28條僅在實(shí)驗(yàn)組中發(fā)現(xiàn)，（見(jiàn)表1），對(duì)照組有74條新發(fā)現(xiàn)的多肽，有41條僅在對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)（見(jiàn)表2），其中有33條為兩者共有的多肽。

圖4 檢測(cè)到的BMDM中新發(fā)現(xiàn)多肽維恩

在兩組中共有的33條多肽，它們的母體蛋白及氨基酸序列分別：為，半乳糖凝集素1為：GEVASDAKSFVLNL，KVRGEVASDAKSFVLNL，DQADLTIKL；波形 蛋白為 ：NKILLAELEQL，EQQNKILLAELEQL，LEQQNKILLAELEQL，SLPLVDTHSKRTLL，SVP-GVRLLQDSVD，、TTSTRTYSLGSALRPSTS；肽基-脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶A為：NAGPNTNGSQFFICTAKTEWL，ANAGPNTNGSQFFICTAKTEWL，ANAGPNTNGSQFFICTAKTEWLDGKHVVF；組織蛋 白 酶 B：為IDLPETFDAREQW，DIDLPETFDAREQW，GIESEIVAGIPRTD，GIESEIVAGIPRTDQ；組織蛋白酶Z為SNDGIEYWIVRN；SH 3結(jié)構(gòu)域結(jié)合富含谷氨酸的蛋白質(zhì)為:QDTLQEFLKLA；脫氧核糖核酸酶-2-α為:LSCYGDSGQPVDWFVVYKLPAHSG；胱抑素-B為:KRQIVAGTNLFIKV；ATP合成酶亞基d，線粒體為:KSWNETFHARLASL；甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1為:LAASNLALSAL；溶菌酶C2為:SALLQDDITAAIQCA和NRGDQSTDYGIFQI；附睪特異性α-甘露糖苷酶為:ILSVPGWTYSR；補(bǔ)體成分1 Q子成分結(jié)合蛋白為:LHTEGDKAFVEFLTDEI；半乳糖凝集素3為:GTVKPNANRIVLDF；原肌球蛋白α-4鏈為:KTIDDLEEKLAQ；磷脂酶D 4為:QPGATTVQEQLR；細(xì)絲A為:HIPGSPLQFYVDYV；組織蛋白酶D為:EPVSELLKNY;絲切1為EKLGGSAVISLEGKPL和KEILVGDVGQTVDDPYTTFV。

表1 實(shí)驗(yàn)組胞內(nèi)鑒定的多肽序列

表2 對(duì)照組胞內(nèi)鑒定的多肽序列

從多肽序列中可以看出，本研究中得到的多肽主要是C端氨基酸為亮氨酸（Leu），而多肽的生理活性和其末端氨基酸的種類有一定的關(guān)系。在之前的研究發(fā)現(xiàn)，具有DPP-IV抑制性的多肽具有共同的特征：N-末端為疏水性氨基酸Trp，Leu，Ile或Phe、第二位為Pro或Ala，C-末端氨基酸為Pro[15-16]。但是本次研究中得到的多肽功能與其末端氨基酸之間的關(guān)系還需進(jìn)一步探究。

在本研究中共有102條新發(fā)現(xiàn)的多肽，由8～29氨基酸組成，其中以10～20氨基酸肽數(shù)量最多，有85條，占據(jù)83%，均是3 ku以下的多肽（結(jié)果如圖5所示），在之前的研究中也出現(xiàn)過(guò)類似的情況。Yin[17]等人對(duì)小鼠和大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞多肽進(jìn)行分析，結(jié)果鑒定出57條來(lái)自24條母體蛋白的多肽，其中10～20氨基酸肽有42條，0～10肽有10條，20～30肽有5條。在對(duì)人細(xì)胞系SH-SY5Y，MCF7和HEK293進(jìn)行多肽分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，三種細(xì)胞中共鑒定了272條多肽，這些多肽的分子量在578～3256 u,平均分子質(zhì)量約為1374 u，也即得到的多肽平均為10肽[11]。這些小分子多肽與很多研究中發(fā)現(xiàn)的有生物活性多肽相似：一般由3～30個(gè)氨基酸組成，分子量在3 ku以下[18-20]。Bowdish[21]等人在研究來(lái)源于牛中性粒細(xì)胞的13氨基酸肽indolicidin的免疫功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，多肽indolicidin在巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系中抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)量。Elfahri等[22]采用3種瑞士乳桿菌菌株ASCC474，ASCC1188和ASCC13153在37℃條件下發(fā)酵牛奶蛋白；獲得含有4～18個(gè)氨基酸殘基的短肽混合物，這些肽具有免疫調(diào)節(jié)的功能，均可以促進(jìn)人外周血單核細(xì)胞（PBMCS）中IL-10的分泌與IFN-γ的表達(dá)量。從巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的這些小分子多肽很有可能存在一些生物活性，其功能特性還有待研究。

圖5 新發(fā)現(xiàn)的多肽氨基酸數(shù)分布

3 結(jié)束語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)采用小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞作為研究對(duì)象，對(duì)獲得的巨噬細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎后，用10 ku超濾管處理，采用納升液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（Nano LC-Q-TOFMS）對(duì)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)的所有多肽進(jìn)行了全面掃描及鑒定分析，全面分析探索小鼠巨噬細(xì)胞來(lái)源的多肽的種類、數(shù)量，比較LPS刺激組和未刺激組多肽種類及數(shù)量，分析可能的生物活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終建立了一個(gè)特定的“肽數(shù)據(jù)庫(kù)”，包含340條胞內(nèi)多肽，發(fā)現(xiàn)其中102條是從未公開(kāi)報(bào)道的新肽，這些多肽大多數(shù)都是由20個(gè)以下氨基酸組成的多肽，具有潛在的生物活性。關(guān)于這些多肽所具有的生物活性和功能還需進(jìn)一步研究?，F(xiàn)在市面上已經(jīng)出現(xiàn)生物活性肽產(chǎn)品，本研究為動(dòng)物體內(nèi)具有特定功能的生物活性肽產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供借鑒。