孔令偉 時(shí)敬文 胡金 董官波

（弘和制藥有限公司 吉林 梅河口 135000）

銀杏葉提取物制劑為靜脈注射劑，由銀杏葉提取物及部分輔料制成的滅菌水溶液，其主要成分為總黃酮、萜類內(nèi)酯。其中總黃酮及萜類內(nèi)酯為銀杏葉提取物的主要成分，因?yàn)橹兴幊煞值膹?fù)雜性，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均對(duì)主要成分的含量進(jìn)行檢測(cè)，其中銀杏內(nèi)酯具有抑制血小板聚集作用[1]，對(duì)中風(fēng)、老年癡呆癥等疾病具有明顯功效[2]，因此其含量檢測(cè)方法成為內(nèi)酯研究的熱點(diǎn)，本文通過(guò)使用高效液相色譜法檢驗(yàn)銀杏內(nèi)酯A、B、C、及白果內(nèi)酯來(lái)指征銀杏總內(nèi)酯的含量，并對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明該檢驗(yàn)方法可用于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

1.儀器和材料

Agilent 1260液相色譜儀，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD，Agilent公司)，甲醇為色譜純（Fisher公司）；梅特勒-托利多十萬(wàn)分天平（型號(hào)MS105DU）；其余試劑均為分析純。

銀杏葉提取物制劑為某制藥公司提供（批號(hào)：20170501，20170610）；白果內(nèi)酯（批號(hào)110865-201507）、銀杏內(nèi)酯C（批號(hào)110864-201508）銀杏內(nèi)酯A（批號(hào)110862-201612）、和銀杏內(nèi)酯B（批號(hào)110863-201611）由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

2.溶液制備

2.1 對(duì)照品溶液的制備：

取白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯C、銀杏內(nèi)酯A、和銀杏內(nèi)酯B對(duì)照品適量，用75%甲醇配成每1ml分別白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯C銀杏內(nèi)酯A、和銀杏內(nèi)酯B對(duì)照品0.2mg、0.3mg、0.3mg和0.1mg的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備：

精密量取裝量項(xiàng)下供試品溶液30ml，置50ml具螺紋蓋離心管中，加入乙酸乙酯20ml，旋緊蓋子，混勻，打開，放氣，再旋緊蓋置渦旋振蕩器中振蕩1分鐘，離心（2000轉(zhuǎn)/分鐘）10分鐘，吸取乙酸乙酯置蒸發(fā)皿中，再加入乙酸乙酯5ml，重復(fù)操作5次，合并6次乙酸乙酯液，于80度水浴中蒸至近干，用4ml甲醇分次轉(zhuǎn)移至10ml離心管中，小心吹干甲醇，再精密加入75%甲醇0.5ml，渦旋使溶解，過(guò)0.22um的濾膜，取續(xù)濾液；或高速離心取上清液，即得。

3.色譜條件

Agilent ZOBAX SB-C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）色譜柱，柱溫為35℃，以甲醇：0.1%甲酸（20∶80）為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。蒸發(fā)溫度為120℃，霧化溫度為90℃，載氣流速為1.1ml/min。進(jìn)樣量：分別精密吸取對(duì)照品溶液3μl～10μl及供試品溶液5～10μl，注入液相色譜儀。

4.方法學(xué)考察

4.1 方法學(xué)摸索

4.1.1 由于每1ml制劑產(chǎn)品中僅含0.16～0.17mg銀杏葉提取物，推算其萜類內(nèi)酯含量約在5～10μg/ml，含量較低，為達(dá)到檢測(cè)靈敏度，需要從檢測(cè)和供試品前處理兩方面均考慮，盡量提高檢測(cè)靈敏度，滿足含量測(cè)定的定量要求。

4.1.2 色譜條件的確定

（1）蒸發(fā)光散射檢測(cè)參數(shù)

研究發(fā)現(xiàn)，蒸發(fā)光檢測(cè)器的蒸發(fā)溫度和霧化溫度越高，4種待測(cè)成分的響應(yīng)就越高；待測(cè)成分的響應(yīng)隨著氣體流速的降低而升高，至1.1ml/min時(shí)，響應(yīng)最高[3]。

最終蒸發(fā)光散射檢測(cè)器確定參數(shù)為：霧化溫度90℃，蒸發(fā)溫度為120℃，氣體流速為1.1ml/min。由于注射液中萜類內(nèi)酯含量低，如檢測(cè)器靈敏度不夠可能導(dǎo)致無(wú)法檢出，因此在標(biāo)準(zhǔn)中細(xì)化蒸發(fā)光檢測(cè)器參數(shù)作為參考。

（2）流動(dòng)相酸度

研究發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相具有一定酸度會(huì)增強(qiáng)萜類內(nèi)酯信號(hào)，考慮到蒸發(fā)光散射器特性，選擇揮發(fā)性酸甲酸進(jìn)行考察，比較水、0.01%甲酸、0.1%甲酸和0.5%甲酸作為水相與甲醇洗脫時(shí)，發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸為流動(dòng)相水相時(shí)響應(yīng)最強(qiáng)，因此選擇流動(dòng)相為0.1%甲酸-甲醇（80∶20）。

確定色譜條件下，4種萜類內(nèi)酯分離較好，供試品中無(wú)雜峰干擾4種待測(cè)成分（見圖1）。

4.1.3 供試品前處理方法摸索 分別摸索了取大體積注射液，進(jìn)行濃縮后再液液萃取的方法（方法1和方法2，同時(shí)比較不同溶劑提取效率）、直接取少量注射液進(jìn)行渦旋萃?。ǚ椒?）、固相萃取方法（方法4）和直接液液萃取方法（方法5），具體方法如下。

（1）方法1：精密吸取裝量項(xiàng)下供試品溶液300ml，至500ml圓底燒瓶中減壓濃縮至近干，加無(wú)水乙醇100ml溶解殘?jiān)?，過(guò)濾，取濾液至蒸發(fā)皿中，于水浴蒸至約2ml 轉(zhuǎn)移至50ml具螺紋蓋的離心管中，用無(wú)水乙醇2ml洗滌蒸發(fā)皿轉(zhuǎn)移至同一離心管中，再量取水10ml清洗圓底燒瓶同樣轉(zhuǎn)移至同一離心管中，用乙醚約20ml清洗上述蒸發(fā)皿，轉(zhuǎn)移至同一離心管中，旋緊蓋子后混勻，打開蓋放氣，再旋緊蓋置至渦旋振蕩器中振蕩1分鐘，離心（3000轉(zhuǎn)/分鐘）5分鐘，分取上層乙醚液體至蒸發(fā)皿中，再加入乙醚20ml，按照上述提取步驟提取，分離乙醚，重復(fù)操作4次，合并5次提取的乙醚液，室溫?fù)]至近干，加甲醇定容至5ml。

圖1 注射液中萜類內(nèi)酯含量測(cè)定色譜圖

（2）方法2：精密吸取裝量項(xiàng)下供試品溶液300ml，至500ml圓底燒瓶中減壓濃縮至近干，加無(wú)水乙醇100ml溶解殘?jiān)?，過(guò)濾，取濾液至蒸發(fā)皿中，于水浴蒸至約2ml轉(zhuǎn)移至50ml具螺紋蓋的離心管中，用無(wú)水乙醇2ml洗滌蒸發(fā)皿轉(zhuǎn)移至同一離心管中，再用水10ml清洗圓底燒瓶同樣轉(zhuǎn)移至同一離心管中，用乙酸乙酯約20ml清洗上述蒸發(fā)皿，轉(zhuǎn)移至同一離心管中，旋緊蓋子后混勻，打開蓋放氣，再旋緊蓋置至渦旋振蕩器中振蕩1分鐘，離心（3000轉(zhuǎn)/分鐘）5分鐘，分取上層乙酸乙酯液體至蒸發(fā)皿中，再加入乙酸乙酯20ml，按照上述提取步驟提取，分離乙酸乙酯，重復(fù)操作4次，合并5次提取的乙酸乙酯液，室溫?fù)]至近干，加甲醇定容至5ml。

（3）方法3：精密吸取裝量項(xiàng)下供試品溶液30ml，置50ml具螺紋蓋的離心管中，加25%鹽酸2滴，加入乙酸乙酯10ml，旋緊蓋子后混勻，打開蓋放氣，再旋緊蓋置渦旋振蕩器中振蕩1min，離心（3000轉(zhuǎn)/min）5分鐘，取上層乙酸乙酯置蒸發(fā)皿中，再加入乙酸乙酯5ml，按上述提取步驟提取，分離乙酸乙酯，重復(fù)操作4次，合并5次提取的乙酸乙酯液，置80度水浴中蒸至近干，用3ml甲醇分次洗脫至10ml離心管中，吹干甲醇后，再精密加入50%甲醇0.5ml，渦旋使溶解，離心，取上清液，即得。

（4）方法4∶精密吸取裝量項(xiàng)下供試品溶液50ml，過(guò)經(jīng)活化后的固相萃取柱(Waters HLB 6CC，使用前加6ml甲醇過(guò)柱，棄去甲醇，再加6ml水過(guò)柱，棄去水進(jìn)行活化；流速：1滴/秒；)，棄去已過(guò)柱的供試品，量取乙酸乙酯6ml洗脫固相萃取柱，收集乙酸乙酯洗脫液，至10ml具螺紋蓋的離心管中，吹干，精密加入甲醇1ml，渦旋振蕩溶解，離心，取上清液，即得。

（5）方法5：精密吸取裝量項(xiàng)下供試品溶液100ml，量取乙酸乙酯40ml萃取，分取上層乙酸乙酯液體至蒸發(fā)皿中，再加入乙酸乙酯30ml按照上述提取步驟提取，分離乙酸乙酯，重復(fù)操作3次，合并4次提取的乙酸乙酯液，（每次萃取時(shí)將乳化的上層轉(zhuǎn)移至50ml具螺紋蓋的離心管中，離心，再吸取乙酸乙酯至蒸發(fā)皿中），置水浴上揮至近干，加3ml甲醇分次清洗蒸發(fā)皿，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，吹干，殘?jiān)蛹状级ㄈ葜?ml。

取上述不同前處理方法制備的供試品溶液，按照既定的色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見表。

表 不同前處理方法萜類內(nèi)酯結(jié)果

結(jié)果表明：（1）大體積供試品進(jìn)行蒸干后提取，供試品中白果內(nèi)酯含量大大降低，可能在蒸干過(guò)程中損失；（2）方法1和和方法2分別采用乙醚和乙酸乙酯，結(jié)果表明乙酸乙酯提取效率高；（3）采用固相萃取與渦旋提取兩種方法，提取效率最高；（4）研究中按照方法4固相萃取法采用另一家品牌的固相萃取柱（愛捷爾）進(jìn)行前處理，結(jié)果均未檢出4種萜類內(nèi)酯，方法耐用性受色譜柱品牌所限。

綜上，渦旋提取法提取效率高，且操作簡(jiǎn)便，快速，故選用該法作為前處理方法，銀杏葉提取物制劑中萜類內(nèi)酯含量測(cè)定檢驗(yàn)方法可用于銀杏葉提取物制劑萜類內(nèi)酯含量的質(zhì)量控制，該方法線性在0.9994～0.9999范圍內(nèi)，準(zhǔn)確性、靈敏度均較高。