徐媛 郭遙 袁斯明 王慜 陳海妮 沈衛(wèi)民

幼兒血管瘤（Infantile hemangioma，IH）是兒童最常見(jiàn)的良性腫瘤之一，多發(fā)于頭面部[1]，嚴(yán)重時(shí)對(duì)兒童的外觀影響較大。該病具有一個(gè)獨(dú)特的自然消退過(guò)程，瘤體通常會(huì)在出生后6個(gè)月內(nèi)迅速增長(zhǎng)，大部分會(huì)在1歲之后自行消退，這一過(guò)程始終伴隨著脂肪形成的現(xiàn)象[2]。

Khan等[3]的研究揭示了血管瘤的起源細(xì)胞可能是一群特殊的間充質(zhì)干細(xì)胞，即血管瘤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞 （Hemangioma-derived mesenchymal stem cells，Hem-MSCs），我們的前期研究也已證實(shí)Hem-MSCs是瘤體消退過(guò)程中脂肪形成的細(xì)胞基礎(chǔ)[4]。在血管瘤病理演變過(guò)程中必然伴隨著脂肪分化相關(guān)基因表達(dá)的變化，其中PPAR-gamma基因是控制間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因[5]。研究證實(shí)，PPAR-gamma的激動(dòng)劑羅格列酮能促進(jìn)BMSCs成脂分化過(guò)程[6]。因此，我們推測(cè)羅格列酮亦可能通過(guò)激活PPAR-gamma信號(hào)通路，從而影響Hem-MSCs的成脂分化過(guò)程。

本研究旨在探討羅格列酮對(duì)Hem-MSCs成脂分化的影響，從而為羅格列酮應(yīng)用于IH患兒，以加速其血管瘤消褪進(jìn)程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本

瘤體標(biāo)本取自南京市兒童醫(yī)院燒傷整形科，系臨床手術(shù)切除的增生期新鮮嬰幼兒血管瘤標(biāo)本，共9例，均經(jīng)患兒父母授權(quán)同意。

1.1.2 主要試劑與儀器

DMEM、青鏈霉素溶液（Hyclone，美國(guó)），F(xiàn)BS、胰蛋白酶（Gibco，美國(guó)），羅格列酮原粉（天津武田），GW9662（Merck，美國(guó)），胰島素、地塞米松、異丁基-甲基黃嘌呤（Sigma，美國(guó)），吲哚美辛（華中藥業(yè)），PCR引物（吉?jiǎng)P基因），Matrigel基質(zhì)膠（BD，美國(guó)），Perilipin A抗體（Abcam，美國(guó)），油紅干粉（Amresco，美國(guó)），MaxVisionTM即用型免疫組化檢測(cè)試劑盒（邁新生物）。

倒置相差顯微鏡（重慶奧特），顯微攝像頭（Jenoptik，德國(guó)），流式細(xì)胞儀（BD-FA6Calibur，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

參考文獻(xiàn)[7]的方法，采用貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)Hem-MSCs。去除標(biāo)本上多余的皮膚和脂肪組織，完整剝離出瘤體，將腫瘤組織剪碎成約1 mm3的小塊，均勻分散地貼于6 cm培養(yǎng)皿中，加入L-DMED/10%FBS培養(yǎng)基，37℃、5%CO2下培養(yǎng)4 d，隨后隔天更換培養(yǎng)基，直至組織塊周?chē)莱鲩g充質(zhì)干細(xì)胞；去除組織碎片及懸浮細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增，傳代至第3代后為純化的細(xì)胞系。細(xì)胞定期傳代擴(kuò)增，凍存于液氮中備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

按不同條件培養(yǎng)基分5組，包括：A組（普通培養(yǎng)基，即L-DMED/10%FBS）、B組（1μM羅格列酮+普通培養(yǎng)基）、C組（成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，10μg/mL胰島素+1μM地塞米松+0.5 mM異丁基甲基黃嘌呤+60μM吲哚美辛）、D組（1μM羅格列酮+成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基）、E組（2μM GW9662+1μM羅格列酮+成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基）。

1.2.3 油紅O染色

將2.5 mL細(xì)胞懸液接種于六孔板中，共接種兩板，每板接種5孔，細(xì)胞貼壁并進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后按實(shí)驗(yàn)分組更換培養(yǎng)基，隨后隔天換液，兩板細(xì)胞分別培養(yǎng)至第7天和第14天。先在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞分化情況；再用4%多聚甲醛固定后，行油紅O染色，倒置相差顯微鏡下觀察脂滴形成情況。

1.2.4 Western－blot檢測(cè)

將Hem-MSCs接種于5個(gè)10 cm培養(yǎng)皿，進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后按實(shí)驗(yàn)分組更換培養(yǎng)基，隨后隔天換液，培養(yǎng)直至細(xì)胞密度達(dá)到80%。定期觀察，培養(yǎng)2周后，收獲細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。將細(xì)胞收集到EP管中，加入裂解液，在冰上裂解15 min后超聲破碎細(xì)胞，離心取上清后調(diào)整蛋白濃度至2μg/μL，將樣本點(diǎn)入加樣孔后開(kāi)始電泳（濃縮膠80 mA，20 min；分離膠120 mA，1 h），電泳結(jié)束后，在4℃、300 mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜150 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉液（含5%脫脂牛奶的TBST溶液）室溫封閉1 h，一抗孵育2 h，TBST洗膜4次，每次8 min，后二抗孵育1.5 h，TBST洗膜4次，每次8 min，加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶，加入定影劑定影10 min至膠片透明，清洗并室溫晾干后進(jìn)行分析。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR

將細(xì)胞接種于6孔板（每板接種5組，共接種3板，每組各3孔），細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后按實(shí)驗(yàn)分組更換培養(yǎng)基，隨后隔天換液，培養(yǎng)7天時(shí)收集細(xì)胞。按照說(shuō)明書(shū)操作，以Trizol法抽提RNA，使用分光光度計(jì)測(cè)定所抽提RNA的濃度以及質(zhì)量，RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，隨后以?xún)刹椒ㄟM(jìn)行PCR反應(yīng)，每12μL PCR反應(yīng)體系包括SYBR premix ex taq 6.0μL、上游引物（5μM）0.5μL、下游引物（5μM）0.5μL、模板（反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）1.0μL、RNase-Free H2O 4.0μL（表1）。反應(yīng)條件：起始，95℃30 s ec；兩步PCR，95℃5 sec，60℃30 sec，共40個(gè)循環(huán)；分離，95℃15 sec，60℃30 sec，95℃15 sec（圖1）。相對(duì)定量分析F=2-ΔΔCt（ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值；-ΔΔCt=NC組ΔCt平均值-各樣品ΔCt值；2-ΔΔCt反映各樣品相對(duì)NC組，即A組第1周第1組，樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)水平）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以表示，運(yùn)用單因素方差分析和t檢驗(yàn)行相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

圖1 兩步法RT-PCR熔解曲線Fig 1 Two-step RT-PCR melting curve

2 結(jié)果

2.1 油紅O染色

培養(yǎng)至第7天和第14天時(shí)，A組和B組的細(xì)胞均未見(jiàn)明顯脂肪分化。進(jìn)行成脂誘導(dǎo)的另外3組在培養(yǎng)第7天時(shí)即可觀察到脂滴形成，第14天時(shí)成脂分化的細(xì)胞數(shù)量明顯多于第7天時(shí)；其中D組細(xì)胞成脂分化更加明顯，可見(jiàn)大量成串的脂滴形成；E組的成脂分化程度明顯低于D組，但接近C組。油紅O染色發(fā)現(xiàn)，D組的染色面積明顯大于C、E組（圖2）。

2.2 Western－blot檢測(cè)

A、B組的perilipin A蛋白的表達(dá)量極低，C組和E組的蛋白表達(dá)量稍高，D組的蛋白表達(dá)量明顯高于其他4組（圖3）。

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR

分別于第1周和第2周時(shí)檢測(cè)各組細(xì)胞脂肪分化相關(guān)基因（CEBPA、LPL、PLIN1、PPARG）的表達(dá)情況，每種基因均以第一周A組的基因表達(dá)量為對(duì)照值，以比較相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，各基因在A組和B組的相對(duì)表達(dá)量均極低，且在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上無(wú)明顯變化（P＞0.05），而C組和E組的基因相對(duì)表達(dá)量相當(dāng)，均較A組和B組稍高（P＜0.05），第2周時(shí)C組和E組的基因表達(dá)量均有所上升但增長(zhǎng)并不明顯。D組的基因相對(duì)表達(dá)量明顯高于其他4組，而且相比第1周，其第2周時(shí)的基因表達(dá)量有明顯增長(zhǎng)（P＜0.05）（圖4）。

圖2 各組細(xì)胞形態(tài)觀察Fig．2 Morphological observation of cells in each group

圖3 Western-blot檢測(cè)各組Perilipin A蛋白表達(dá)情況Fig.3 The expression of Perilipin A protein in each group detected by Western-blot

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。目前的研究結(jié)果認(rèn)為，脂肪分化的調(diào)控基因主要包括PPAR-gamma、CEBPA、LPL和ADD1等[8]。其中，PPAR-gamma的高表達(dá)能正向調(diào)控脂肪細(xì)胞形成的過(guò)程，是脂肪分化過(guò)程中不可或缺的，這種調(diào)控作用主要在脂肪分化的早期階段[9]。

Yu等[10]的研究證實(shí)，Hem-MSCs能夠高表達(dá)PPAR-gamma基因，我們的前期研究證實(shí)，PPARgamma基因在血管瘤消退期和消退完成期均大量表達(dá)，說(shuō)明PPAR-gamma信號(hào)通路參與了血管瘤消退過(guò)程[4]。相關(guān)研究也證實(shí)PPAR-gamma的激動(dòng)劑羅格列酮能促進(jìn)BMSCs的成脂分化過(guò)程[6]。因此，我們推測(cè)這種促進(jìn)作用對(duì)于Hem-MSCs同樣有效。

在體外的細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)在未給予脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組別中，給予羅格列酮藥物刺激并不能促使細(xì)胞進(jìn)入脂肪分化過(guò)程，而在脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基條件下，羅格列酮給藥組能夠觀察到大量分化的脂肪細(xì)胞，油紅O染色也顯示該組中有大量成串的脂滴形成，且在給藥到第2周時(shí)我們能觀察到更多脂滴形成，較第1周時(shí)明顯增多。

Western－blot檢測(cè)顯示，A、B組中僅有極少的Perilipin A蛋白表達(dá)，而在給予成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基的另外3組中，加入羅格列酮可使Perilipin A蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯增長(zhǎng)。

我們通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)了成脂分化相關(guān)基因（CEBPA、LPL、PLIN1和PPARG等）的表達(dá)情況，結(jié)果也證實(shí)羅格列酮能夠促進(jìn)Hem-MSCs中成脂分化相關(guān)基因在脂肪分化各階段的高表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了GW9662拮抗組能抑制了羅格列酮對(duì)Hem-MSCs成脂分化的影響，也進(jìn)一步說(shuō)明了羅格列酮的相關(guān)促進(jìn)作用是通過(guò)PPAR-gamma信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

本研究結(jié)果顯示，羅格列酮單純激活PPARgamma信號(hào)通路并不能啟動(dòng)Hem-MSCs的成脂分化過(guò)程，而是在Hem-MSCs已經(jīng)具備成脂分化微環(huán)境的前提下，通過(guò)在成脂分化早期促使PPAR-gamma基因高表達(dá)，從而調(diào)控其他下游基因的表達(dá)，以達(dá)到促進(jìn)成脂分化的結(jié)果。

圖4 PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組Hem-MSCs細(xì)胞成脂肪分化基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Detection of relative expression of adipogenic differentiation genes in hem-MSCs cells at different time points by PCR

有研究表明，IH瘤體內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞與Hem-MSCs接觸時(shí)會(huì)通過(guò)wnt信號(hào)通路抑制Hem-MSCs的成脂分化[11]，而wnt信號(hào)通路主要是通過(guò)抑制PPARγ和CEBPA兩種基因的表達(dá)來(lái)達(dá)到抑制成脂分化的效果[12]。當(dāng)IH進(jìn)入消退期時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞大量凋亡，這種抑制作用消失，Hem-MSCs逐漸進(jìn)入成脂分化進(jìn)程，這是IH的自然消退過(guò)程。本研究結(jié)果證實(shí)羅格列酮可促進(jìn)Hem-MSCs在體外的成脂分化過(guò)程，該促進(jìn)作用是通過(guò)激活PPAR-gamma信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，且在這一過(guò)程中明確提高了CEBPA和PPARG基因的表達(dá)。因此，我們認(rèn)為羅格列酮能夠加速I(mǎi)H的消退進(jìn)程。

IH的消退過(guò)程包括內(nèi)皮細(xì)胞的大量凋亡和Hem-MSCs的成脂分化兩個(gè)重要方面，目前我們的研究?jī)H是體外實(shí)驗(yàn)，羅格列酮在體內(nèi)是否同樣能夠發(fā)揮這樣的促進(jìn)作用，是否同時(shí)能夠加速內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，最終加快IH的消退過(guò)程，則需要進(jìn)一步的研究去證實(shí)。