許英一 徐艷霞 王 宇 林 巍 吳紅艷 孟祥雯

(1. 齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

玉米須為禾本科玉蜀黍屬植物玉米的花柱和花頭，常集結成疏松團簇，花柱線狀或須狀，淡綠色、黃綠色至棕紅色，有光澤，略透明，具有消腫、利尿、平肝、利膽之功效[1]。作為玉米的副產物，玉米須來源豐富，含有多酚類等多種有機物質。據臨床研究證明玉米須多酚具有抗菌[2]、降血糖[3]、抗氧化[4-6]、預防心血管疾病[7]等方面的藥理功效。

植物多酚的提取方法很多，如醇提法、超聲波輔助法、酶提法、超臨界萃取[8-9]等。醇提法操作簡便、成本低廉，但試劑耗量大、提取率較低；酶提法提取率高，但提取費用也高；超臨界萃取操作較繁瑣，且存在安全性問題；超聲提取是一種高效節(jié)能的提取活性物質的新技術[10]，其原理是利用超聲波機械振動產生的空化作用增加物質的提取率[11]。趙麗等[12]采用超聲波、微波和搖床振蕩等輔助提取方法對3種葉菜多酚進行提取，結果表明超聲波輔助提取法顯著增加了葉菜的多酚提取量，較微波輔助提取法3種葉菜多酚增加了3.20%～6.00%，較搖床輔助提取法增加了10.00%～15.00%。張素霞[13]采用超聲波法和醇法2種工藝提取茶多酚，發(fā)現(xiàn)超聲波法提取效果更佳。林樅雨等[14]分別采用醇提、超聲波法和微波法3種工藝提取甜玉米芯多酚，發(fā)現(xiàn)超聲波法效果更佳。蔣麗等[15]采用超聲波、酶法、30 ℃水提、熱回流水提以及纖維素酶輔助超聲波提取法5種工藝提取茶多酚，發(fā)現(xiàn)超聲波法提取率和產品純度較高，且其抗氧化活性最強。鄧義書等[16]采用超聲波法、微波法、索氏提取法和超臨界萃取法4種工藝提取桑葚果渣中總多酚，發(fā)現(xiàn)超聲波法效果最佳。侯敏娜等[17]采用超聲波輔助提取玉米須多酚，得率為4.45%。

采用先加熱后再輔助超聲波提取的提取方式還未見報道。熱處理既可殺菌，又在一定程度上增加了多酚與有機溶劑的結合，增大多酚物質的溶出率。本研究擬采用先加熱后超聲波輔助乙醇提取玉米須多酚，在單因素試驗的基礎上，以玉米須多酚提取率為評價指標，利用響應面法進行優(yōu)化，同時測定了玉米須多酚的抗氧化活性，為玉米須多酚作為添加劑應用于食品行業(yè)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

玉米須：黑龍江畜牧研究所實驗基地；

沒食子酸標準品：中國藥品生物制品檢定所；

乙醇、碳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、水楊酸、硫酸亞鐵、雙氧水、DPPH、ABTS、過硫酸鉀：分析純，天津市光復科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

高速藥物粉碎機：WK-600A型，青州市精誠機械有限公司；

超聲波藥品處理機：JBT/C-YCL型，濟寧金百特工程機械有限公司；

臺式低速離心機：TDL-5-A型，上海安亭科學儀器廠；

水浴恒溫振蕩器：SHA-C型，金壇市天竟實驗儀器廠；

可見分光光度計：722S型，上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 玉米須多酚的提取 準確稱取干燥玉米須粉末5.0 g，按照試驗方案加入一定料液比一定體積分數的乙醇，先加熱浸提40 min后，再超聲輔助提取一定時間，過濾，取濾液即為多酚提取液。

1.2.2 玉米須多酚含量與提取率的測定

(1) 繪制標準曲線：準確稱取20 mg沒食子酸標準品，于200 mL容量瓶中，加去離子水定容至刻度，得到濃度為0.1 mg/mL 標準溶液。分別移取沒食子酸標準溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于6支10.0 mL容量瓶中，用去離子水定容至10 mL。按文獻[11]方法在760 nm處測定吸光度。標準曲線方程為y=0.078x+0.001 9，相關系數R2=0.999 4，線性相關性好。

(2) 多酚含量測定：取多酚提取液2 mL，按照1.2.2(1)方法顯色，在760 nm處測定樣品吸光度，根據標準曲線方程得到玉米須多酚質量，按式(1)計算提取率。

(1)

式中：

c——玉米須多酚提取率，%；

m1——玉米須多酚質量，g；

m2——玉米須質量，g。

1.2.3 單因素試驗 準確稱取干燥玉米須粉末5.0 g，單因素試驗的基本條件為料液比1∶20 (g/mL)，乙醇體積分數60%，浸提溫度50 ℃，浸提時間40 min，超聲時間40 min。本試驗只研究某單一因素條件的變化。料液比分別為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 (g/mL)，乙醇體積分數分別為40%，50%，60%，70%，80%，浸提溫度分別為40，45，50，55，60 ℃，超聲時間分別為10，20，30，40，50 min，按上述設計做單因素試驗。測定多酚提取率，每組3次重復。

1.2.4 響應面試驗設計 根據中心設計試驗原理，在單因素試驗基礎上，固定浸提溫度50 ℃，浸提時間40 min，考察料液比、乙醇體積分數和超聲時間對玉米須多酚提取率的影響，確定最佳提取工藝。

1.2.5 DPPH自由基的清除率的測定 根據文獻[18]。

1.2.6 羥自由基清除率的測定 根據文獻[19]。

1.2.7 ABTS自由基清除率的測定 根據文獻[20]。

1.3 數據分析

運用Excel、Design-Expert 8.0.6 和SPSS 19.0軟件對數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比 由圖1 可知，玉米須多酚提取率隨溶劑量的增加而上升，料液比為1∶20 (g/mL)達到最大值，后稍有下降?？赡苁窃龃笕軇┝浚固崛∵^程中溶劑與玉米須多酚溶質間的濃度差增大，有利于傳質，因此提高了提取率；到達峰值后，隨著溶劑量的繼續(xù)增大，反而起到稀釋的效果。因此選擇最適料液比為1∶20 (g/mL)。

2.1.2 乙醇體積分數 由圖2 可知，玉米須多酚提取率隨乙醇體積分數的增加先上升后下降，當乙醇體積分數為60%時最高。可能是多酚中含有酚酸類物質，具有一定極性，根據相似相溶原理，多酚易溶出，當乙醇體積分數增加到一定值后，因水量減少，乙醇量增多，導致非極性強的乙醇溶液對具有一定極性多酚的提取率下降。因此選擇最適乙醇體積分數為60%。

圖1 料液比對玉米須多酚提取率的影響Figure 1 Impact analysis of solid-liquid ratio

圖2 乙醇體積分數對玉米須多酚提取率的影響Figure 2 Impact analysis of volume fraction of ethanol

2.1.3 浸提溫度 由圖3 可知，玉米須多酚提取率隨浸提溫度的增加先上升后下降，當溫度為50 ℃時最高?？赡苁菧囟壬撸掖嫉酿ざ冉档?，分子間的熱運動增大，多酚類物質的溶解和擴散速度加快，使提取率提高[21]；當溫度升高到50 ℃以上，長時間加熱會破壞多酚結構而導致提取率下降。因此選擇最適浸提溫度為50 ℃。

2.1.4 超聲時間 由圖4可知，玉米須多酚提取率隨超聲時間的延長先上升后稍有下降，當超聲40 min時最大?？赡苁浅暡ㄍㄟ^機械效應、空化效應和熱效應，提高了乙醇分子的運動速度，增大了溶劑的穿透能力，從而提高了多酚提取率；超聲40 min時，溶解在溶劑中的多酚類物質的濃度與細胞外液的濃度基本達到平衡，之后，多酚提取率稍有下降。因此選擇最適超聲時間為40 min。

圖3 浸提溫度對玉米須多酚提取率的影響Figure 3 Impact analysis of extraction temperature

圖4 超聲時間對玉米須多酚提取率的影響Figure 4 Impact analysis of ultrasonic time

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 試驗設計及結果 在單因素試驗基礎上，應用三因素三水平的中心組合試驗設計優(yōu)化玉米須多酚提取的最佳條件。因素水平表見表1，試驗設計與結果見表2。

表1 試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of experiment

表2 試驗設計與結果Table 2 Design and results of experiment

2.2.2 建立模型與數據分析 采用Design-Expert 8.0.6 軟件對試驗結果進行統(tǒng)計分析，得到玉米須多酚提取率與提取工藝參數的二次回歸方程為：

Y=6.43+0.37A+0.099B-0.078C-0.19AB-0.20AC-0.020BC-0.50A2-0.20B2-0.14C2。

(2)

對該模型進行回歸分析，得出分析結果見表3。從表3可以看出，回歸模型的P<0.000 1，說明該模型具有統(tǒng)計學意義，可以用來分析和預測超聲波輔助法提取玉米須多酚的效果。同時模型失擬項(0.218 8)不顯著，模型R2為0.982 8，adj-R2為0.960 6，說明回歸方程擬合度良好。根據回歸系數的顯著性分析可知，一次項料液比、乙醇體積分數、超聲時間均對玉米須多酚提取率的影響達到顯著效應。交互項中料液比與超聲時間的交互作用、料液比與乙醇體積分數的交互作用極顯著(P<0.01)，而乙醇體積分數和超聲時間沒有交互作用，二次項對玉米須多酚提取率的影響均達顯著效應。

從圖5、6 可知，料液比與超聲時間兩因素之間具有顯著的交互作用，其次是料液比與乙醇體積分數兩因素之間具有顯著的交互作用，與表1結果一致。采用Design-Expert 8.0.6 軟件分析得到超聲波輔助提取玉米須多酚的最佳工藝條件：料液比1∶22.39 (g/mL)，乙醇體積分數60.00%，超聲時間32.00 min，該條件下提取率為6.55%。為驗證響應面優(yōu)化結果的正確性，將試驗條件調整為料液比1∶22 (g/mL)，乙醇體積分數60%，超聲時間32 min，進行3次平行實驗，得玉米須多酚提取率為(6.49±0.23)%，與理論預測值基本一致，進一步驗證了回歸模型的適合性。玉米須多酚提取率高于侯敏娜等[17]采用超聲提取的玉米須多酚提取率(4.45%)。

表3 響應面模型方差分析?Table 3 ANOVA for the response surface quadratic model

? *表示影響顯著； **表示影響極顯著。

圖5 料液比和乙醇體積分數交互作用等高線圖和響應面圖Figure 5 Response surface and contour plots for the interaction effects of solid-liquid ratio and volume fraction of ethanol

圖6 料液比和超聲時間交互作用等高線圖和響應面圖Figure 6 Response surface and contour plots for the interaction effects of solid-liquid ratio and ultrasonic time

2.3 玉米須多酚抗氧化能力

2.3.1 玉米須多酚對DPPH 自由基清除作用 玉米須多酚及還原型谷胱甘肽對DPPH自由基清除率結果如圖7所示。從圖7可以看出，玉米須多酚和還原型谷胱甘肽均對DPPH自由基具有清除能力，且都與其濃度呈正相關，具有顯著的劑量依賴效應。多酚質量濃度與清除率的回歸方程為y=120.15x+30.903(R2=0.996 1)，其半抑制濃度(IC50值)為0.337 mg/mL；陽性對照還原型谷胱甘肽的質量濃度與清除率的回歸方程為y=52.3x+74.208 (R2=0.990 3)，其IC50值為0.309 mg/mL。玉米須多酚對DPPH自由基清除率相當于還原型谷胱甘肽的量為0.917 mg/mg。

圖7 玉米須多酚對DPPH自由基清除率的影響Figure 7 Effect of polyphenols from corn silk on DPPH radical scavenging rate

2.3.2 玉米須多酚對羥自由基清除作用 玉米須多酚及還原型谷胱甘肽對羥自由基清除率結果如圖8所示。從圖8可以看出，玉米須多酚和還原型谷胱甘肽均對羥自由基具有清除能力，且都與其濃度呈正相關，具有顯著的劑量依賴效應。多酚質量濃度與清除率的回歸方程為y=146.96x+11.022(R2=0.978 6)，其IC50值為0.288 mg/mL；陽性對照還原型谷胱甘肽的質量濃度與清除率的回歸方程為y=139.1x+31.322 (R2=0.953 7)，其IC50值為0.233 mg/mL。玉米須多酚對羥自由基清除率相當于還原型谷胱甘肽的量為0.809 mg/mg。

2.3.3 玉米須多酚對ABTS自由基清除作用 玉米須多

圖8 玉米須多酚對羥自由基清除率的影響Figure 8 Effect of polyphenols from corn silk on hydroxyl radical scavenging rate

酚及還原型谷胱甘肽對ABTS自由基清除率結果如圖9所示。從圖9可以看出，玉米須多酚和還原型谷胱甘肽均對ABTS自由基具有清除能力，且都與其濃度呈正相關，具有顯著的劑量依賴效應。多酚質量濃度與清除率的回歸方程為y=752.4x+9.078(R2=0.996 7)，其IC50值為0.067 mg/mL；陽性對照還原型谷胱甘肽的質量濃度與清除率的回歸方程為y=231.2x+79.046(R2=0.933 9)，其IC50值為0.059 mg/mL。玉米須多酚對ABTS自由基清除率相當于還原型谷胱甘肽的量為0.881 mg/mg。

圖9 玉米須多酚對ABTS自由基清除率的影響Figure 9 Effect of polyphenols from corn silk on ABTS radical scavenging rate

3 結論

(1) 采用超聲波輔助法提取玉米須多酚的最佳工藝條件為：料液比1∶22 (g/mL)，乙醇體積分數60%，超聲時間32 min，超聲溫度60 ℃，在此條件下玉米須多酚提取率為(6.49±0.23)%。

(2) 對優(yōu)化得到的玉米須多酚進行抗氧化活性測定。試驗結果表明：在同等質量的條件下玉米須多酚的抗氧化抑制率雖然略低于還原型谷胱甘肽的，但均具有明顯的抗氧化活性。對DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和ABTS自由基清除率而言，玉米須多酚相當于還原型谷胱甘肽的量分別為0.917，0.809，0.881 mg/mg。

(3) 本研究與傳統(tǒng)的乙醇浸提法、超聲波輔助提取法相比，預熱結合超聲波輔助提取顯著提高了玉米須多酚提取率，后續(xù)如能對提取的玉米須多酚進一步分離純化，將會提高其抗氧化活性。