謝 晶 葉晶鑫 楊勝平 丁靖宇 錢韻芳

(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2. 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

水產(chǎn)品在流通過程中鮮度極易降低，隨著流通時間的延長發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的腐敗變質(zhì)，主要是因為酶自溶，化學(xué)氧化和微生物等多種因素的作用[1]。其中，微生物的生長活性是影響水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要原因。低溫冷藏是延長水產(chǎn)品貨架期最常用的方法，但仍有部分微生物在特定條件下能代謝產(chǎn)生腐敗產(chǎn)物，迅速生長繁殖成為優(yōu)勢菌群，即特定腐敗菌(specific spoilage organism，SSO)[2]。這些特定腐敗菌會降解蛋白質(zhì)產(chǎn)生生物胺、三甲胺等揮發(fā)性散發(fā)腐敗臭味的物質(zhì)，而且研究[3-5]發(fā)現(xiàn)冷藏條件下微生物的生長和對食品的致腐敗能力與微生物之間的相互作用息息相關(guān)。微生物之間的相互作用主要是依靠細菌胞外產(chǎn)物即無菌上清液(cell-free supernatant，CFS)中的群體感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing，QS)的調(diào)控，微生物的群體感應(yīng)系統(tǒng)中含有群體感應(yīng)信號分子，這些信號分子可以調(diào)控自身和環(huán)境中其他微生物生物膜的生長、胞外蛋白酶的合成和活性以及產(chǎn)生腐敗產(chǎn)物的能力等[6-9]。例如Zhu等[8]發(fā)現(xiàn)在25，4 ℃條件下，熒光假單胞菌(P.fluorescens)無菌上清液可以抑制波羅的海希瓦氏菌(S.baltica)的生長和致腐能力。水產(chǎn)品在冷藏條件下，常見的腐敗菌屬有希瓦氏菌、假單胞菌和氣單胞菌等。本課題組[10]前期研究發(fā)現(xiàn)冷藏凡納濱對蝦中的特定腐敗菌是腐敗希瓦氏菌(S.putrefaciens)、P.fluorescens和氣單胞菌屬(Aeromonassp.)，它們都是革蘭氏陰性嗜冷菌。

本試驗主要研究在4 ℃冷藏條件下，P.fluorescens、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila,A.hydrophila)和溫和氣單胞菌(Aeromonassobria,A.sobria)的胞外產(chǎn)物提取液對S.putrefaciens的生長、生物膜的形成、胞外蛋白酶的合成以及致腐能力的影響，以便為開發(fā)新型凡納濱對蝦等水產(chǎn)品的保鮮技術(shù)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

P.fluorescens、A.hydrophila、A.sobria、S.putrefaciens：本課題組前期篩選鑒定所得，菌種于滅菌甘油中-80 ℃ 保藏。

1.1.2 試劑

鐵瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸肉湯(Brain Heart Infusion，BHI)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)：青島海博生物技術(shù)有限公司；

輕質(zhì)氧化鎂、硼酸、鹽酸、檸檬酸鈉、高氯酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、丹酰氯、濃氨水、乙腈等：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

低速離心機：TDL-5-型，上海隆拓儀器設(shè)備有限公司；

滅菌鍋：HVE-50型，日本Hi-rayama公司；

超凈工作臺：VS-1300L-U型，上海康福特環(huán)境科技有限公司；

恒溫培養(yǎng)搖床：THZ-100型，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；

低溫培養(yǎng)箱：DHP-9162型，日本三洋電器集團有限公司；

凱氏定氮儀：Kjeltec2300型，丹麥Foss公司；

氨基酸分析儀：835型，日本日立公司；

高效液相色譜系統(tǒng)：Waters 2695型，Waters 2996 二極管陣列檢測器及Empower 色譜管理軟件，美國Waters公司。

1.3 菌株的活化和培養(yǎng)

P.fluorescens活化和培養(yǎng)參照Parlapani等[11]的方法略有修改：取1 mL凍存的P.fluorescens菌液于滅菌的9 mL 腦心浸肉湯中活化，30 ℃培養(yǎng)24 h左右使菌液濃度達1.0×108CFU/mL后，用于提取無菌上清液。A.hydrophila和A.sobria菌懸液的制備方法同P.fluorescens。

1.4 無菌上清液的提取

將P.fluorescens、A.hydrophila和A.sobria的菌液培養(yǎng)至菌濃度達到108～109CFU/mL后，取培養(yǎng)液在4 ℃、10 000×g離心15 min，取上清液，再用0.22 μm的醋酸纖維過濾膜過濾，得到的溶液即為無菌上清液(CFS)[12]。

1.5 接種與培養(yǎng)

1.5.1 空白對照組(CK組) 取100 μL的S.putrefaciens接種至100 mL的無菌BHI培養(yǎng)基中，置于4 ℃低溫恒溫箱中培養(yǎng)[13]。

1.5.2 試驗組

(1) SP組：取100 μL的S.putrefaciens接種至100 mL 含有50 mL/100 mLP.fluorescensCFS的BHI培養(yǎng)基中，置于4 ℃恒溫箱中培養(yǎng)[13]。

(2) SH組：取100 μL的S.putrefaciens接種至100 mL 含有50 mL/100 mLA.hydrophilaCFS的BHI培養(yǎng)基中，置于4 ℃恒溫箱中培養(yǎng)[13]。

(3) SW組：取100 μL的S.putrefaciens接種至100 mL 含有50 mL/100 mLA.sobriaCFS的BHI培養(yǎng)基中，置于4 ℃恒溫箱中培養(yǎng)[13]。

1.6 CFS對S. putrefaciens生長情況的影響

1.6.1 微生物指標的測定 參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》中的平板計數(shù)法測定，修改如下：先制成1∶10的樣品稀釋液，并梯度稀釋到適當濃度，取2～3個適宜稀釋度的樣品菌液1 mL，與15～20 mL已滅菌的鐵瓊脂培養(yǎng)基混勻。待培養(yǎng)基凝固后置于30 ℃培養(yǎng)48～72 h，計黑色菌落總數(shù)，每個樣品做3次重復(fù)。

1.6.2 胞外蛋白酶的測定 參照Zhu等[8]的方法，修改如下：將培養(yǎng)液在4 ℃、10 000×g離心5 min，采用BCA法測定上清液中胞外蛋白酶的濃度；將離心后的上清液與偶氮酪蛋白底物等體積混合于30 ℃反應(yīng)30 min；再加入等體積的0.5 mol/L三氯乙酸室溫下反應(yīng)30 min；反應(yīng)液在10 000 ×g離心5 min后，與1.0 mol/L的NaOH等體積混合在366 nm 處測吸光度。

U=(a-b)÷0.01，

(1)

式中：

U——蛋白酶活力，U/mL；

a——樣品吸光度；

b——空白組吸光度。

1.6.3 生物膜的測定 將TSB中過夜培養(yǎng)(160 r/min，30 ℃)的S.putrefaciens用無菌的TSB稀釋(1∶1 000)，將稀釋后的液體放入48孔板中，試驗組分為3組，分別加入50 mL/100 mL 的P.fluorescens、A.hydrophila和A.sobriaCFS，置于4 ℃下培養(yǎng)，每隔24 h用結(jié)晶紫結(jié)合法進行測定。首先吸去平板孔中的培養(yǎng)物，并用無菌蛋白胨水(8.5 g/L NaCl，1 g/L蛋白胨)洗滌除去松散貼壁的細胞。干燥后，用0.1 g/L結(jié)晶紫對表面附著的生物膜染色15 min。用無菌蒸餾水洗滌孔板，然后加入95%乙醇重新溶解結(jié)晶紫染色的生物膜。使用酶標儀在600 nm處測吸光度[8]。

1.6.4 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測定 參照Dabad等[14]的方法,修改如下：取3.00 mL培養(yǎng)液，加入少量的蒸餾水，用凱氏定氮儀測定培養(yǎng)液中揮發(fā)性鹽基氮。每組樣品做2個平行。

1.6.5 總氨基酸的測定 按GB 5009.124—2016《食品安全標準 食品中氨基酸的測定》執(zhí)行。

1.6.6 腐胺的測定S.putrefaciens培養(yǎng)液中腐胺的提取參照Ikonic等[15]的方法，然后參照Fan等[16]的方法使用HPLC進行鑒定和定量分析腐胺，每組樣品做3次平行。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 8.6繪制曲線；采用SPSS 19進行顯著性分析。數(shù)據(jù)結(jié)果均采用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)變化

圖1為4 ℃條件下，分別添加50 mL/100 mLP.fluorescens、A.hydrophila和A.sobria無菌培養(yǎng)液對S.putrefaciens生長的影響。初始接菌量大約在5.20 lg(CFU/mL)。從圖1中可以看出，4 ℃貯藏4 d之前，添加50 mL/100 mLP.fluorescens、A.hydrophila和A.sobria無菌培養(yǎng)液對S.putrefaciens的生長幾乎沒有影響；但是貯藏8 d后達到菌落生長穩(wěn)定期時，添加50 mL/100 mLA.sobria無菌培養(yǎng)液組的S.putrefaciens菌落總數(shù)明顯低于空白組，而添加50 mL/100 mLP.fluorescens或A.hydrophila無菌培養(yǎng)液的S.putrefaciens菌落總數(shù)與空白組沒有顯著性差異；貯藏10 d后各組中S.putrefaciens菌落數(shù)基本一致；到達貯藏終點時，添加了50 mL/100 mLA.sobria無菌培養(yǎng)液組中S.putrefaciens的菌落數(shù)明顯呈下降趨勢。研究結(jié)果表明添加50 mL/100 mL 的P.fluorescens或A.hydrophila無菌上清液對S.putrefaciens的生長幾乎沒有影響，而且添加50 mL/100mLA.sobria無菌培養(yǎng)液對S.putrefaciens的生長延滯期和對數(shù)期幾乎沒有影響，但是從穩(wěn)定期初期開始就會抑制S.putrefaciens的生長，與Zhu等[13]研究的P.fluorescens只在穩(wěn)定期抑制S.baltica生長和Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的無菌上清液在穩(wěn)定期提高了腸沙門氏菌(Salmonellaenterica)死亡率的結(jié)果一致。S.putrefaciens是具有群體感應(yīng)機制的細菌，它可以通過感知環(huán)境中的信號分子來調(diào)控菌體密度，并在信號分子達到閾值時啟動相關(guān)基因表達，從而調(diào)控細菌的生理行為，以適應(yīng)環(huán)境的變化，可能是S.putrefaciens可以感知A.sobria無菌上清液中的群體感應(yīng)信號分子去調(diào)控自身的微環(huán)境、物質(zhì)代謝和必要的細胞分裂[12]。

圖1 BHI培養(yǎng)液中添加無菌上清液對S.putrefaciens在4 ℃ 貯藏中菌落總數(shù)變化的影響

Figure 1 Effect of CFS on the growth ofS.putrefacienscultured in BHI broth at 4 ℃

2.2 胞外蛋白酶變化

細菌可以通過無菌上清液中的群體感應(yīng)信號分子去調(diào)控菌體之間的群體行為，特別是對胞外產(chǎn)物的分泌，例如毒力因子、胞外蛋白酶和生物膜基質(zhì)[18-19]。圖2為在4 ℃貯藏下，分別添加50 mL/100 mLP.fluorescens、A.hydrophila和A.sobria無菌上清液對S.putrefaciens形成胞外蛋白酶活性和濃度的影響。從圖2可以看出，不同的貯藏時間段，各試驗組的胞外蛋白酶活性和濃度變化趨勢并不完全相同，是因為S.putrefaciens的胞外蛋白酶活性與濃度之間沒有密切的關(guān)系，但總體趨勢可以看出貯藏8 d 后各組的胞外蛋白酶活性和濃度顯著提高，但貯藏12 d后，胞外蛋白酶活性和濃度明顯降低。與對照組相比，貯藏8 d 后的P.fluorescens、A.hydrophila和A.sobria的無菌上清液明顯降低了S.putrefaciens胞外蛋白酶的形成，而且SP組、SH組和SW組中S.putrefaciens胞外蛋白酶活性分別為8.8，9.8，8.1 U/mL，比對照組活性分別低21.42%，12.50%，27.68%，說明A.sobria的無菌上清液對S.putrefaciens胞外蛋白酶形成的抑制作用最強，從圖2(b)中可以看出，貯藏8 d后，與空白組相比，添加3種無菌上清液對胞外蛋白酶的濃度都有抑制作用，而且添加A.sobria的無菌上清液組(SW組)抑制作用最強，貯藏12 d后，添加A.hydrophila無菌上清液組(SH組)對胞外蛋白酶的濃度幾乎沒有抑制作用，添加P.fluorescens和A.sobria的無菌上清液組對胞外蛋白酶的濃度都有抑制作用，而且SW組的抑制作用最強。這與Zhu等[8]研究添加不同的外源AHLs會抑制S.baltica胞外蛋白酶活力以及Liu等[20]研究發(fā)現(xiàn)P.fluorescens的蛋白酶基因活性受到以AHLs為基礎(chǔ)的群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的結(jié)果一致。

圖2 BHI培養(yǎng)液中添加無菌上清液對S.putrefaciens在4 ℃ 貯藏中胞外蛋白酶活性和濃度的影響

Figure 2 Effect of CFS on extracellular proteolytic acti-vity and protein content ofS.putrefacienscultured in BHI broth at 4 ℃

2.3 生物膜變化

S.putrefaciens具有形成生物膜的能力，并能依靠生物膜附著在容器表面，增加清潔難度并易導(dǎo)致交叉污染。外界營養(yǎng)條件不會影響其在食品加工中形成生物膜的能力，但是外源菌會影響S.putrefaciens形成生物膜的能力和黏附力[21]。圖3為在4 ℃貯藏下，分別添加50 mL/100 mLP.fluorescens、A.hydrophila和A.sobria無菌上清液對S.putrefaciens生物膜形成的影響。貯藏8 d后S.putrefaciens形成生物膜的能力增強，但隨著貯藏時間的延長到達12 d后，S.putrefaciens形成生物膜的能力顯著降低(P<0.05)。與對照組相比，P.fluorescens和A.hydrophila都提高了S.putrefaciens形成生物膜的能力，分別比對照組提高23.33%和56.66%，而A.sobria無菌上清液抑制了S.putrefaciens形成生物膜的能力，抑制率約為18.88%。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)P.aeruginosa的無菌上清液也會抑制S.enterica形成生物膜的能力；Chorianopoulos等[22]發(fā)現(xiàn)哈夫尼亞菌(Hafniaalvei)的無菌上清液也能降低S.enterica形成生物膜的能力；Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn)通過添加外源群體感應(yīng)信號分子AHL會抑制P.aeruginosa形成生物膜的能力，而且許多AHL調(diào)控的基因會在細菌生長的對數(shù)期后期和穩(wěn)定期前期表達[24]，所以出現(xiàn)上述現(xiàn)象是因為在S.putrefaciens中控制形成生物膜的基因受到了外源無菌上清液中群體感應(yīng)信號分子的調(diào)控，例如控制胞外物質(zhì)形成和膜流動性的基因。

圖3 BHI培養(yǎng)液中添加無菌上清液對S.putrefaciens在4 ℃ 貯藏中生物膜形成的影響

Figure 3 Effect of CFS on biofilm development ofS.putrefacienscultured in BHI broth at 4 ℃

2.4 TVB-N值變化

圖4為在4 ℃貯藏下，分別添加50 mL/100 mLP.fluorescens、A.hydrophila和A.sobria無菌上清液對S.putrefaciens形成TVB-N能力的影響。從圖4中可以看出，第0～6天各組的TVB-N值顯著上升，當貯藏6 d之后，各個試驗組TVB-N值上升緩慢，與菌落總數(shù)研究結(jié)果一致，說明當貯藏到細菌生長的穩(wěn)定期初期時，S.putrefaciens產(chǎn)TVB-N的能力受到各組外源細菌無菌上清液的影響而下降。與對照組相比，P.fluorescens和A.hydrophila的無菌上清液對S.putrefaciens形成TVB-N 能力沒有顯著性的影響，A.sobria無菌上清液顯著降低了S.putrefaciens產(chǎn)TVB-N的能力，說明A.sobria無菌上清液降低了S.putrefaciens產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的能力。很多腐敗菌的腐敗過程都會受到無菌上清液中群體感應(yīng)信號分子的調(diào)控，例如蛋白酶、脂肪酶、纖維素和果膠酶的分泌[25]。Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn)含有AHLs的培養(yǎng)液會降低P.aeruginosa的脂肪酶活性，提高蛋白酶活性，從而影響P.aeruginosa產(chǎn)生腐敗產(chǎn)物的量。所以A.sobria無菌上清液顯著降低了S.putrefaciens產(chǎn)TVB-N的能力可能是A.sobria無菌上清液中的AHLs化合物抑制了與S.putrefaciens產(chǎn)TVB-N相關(guān)的蛋白酶的分泌。

圖4 BHI培養(yǎng)液中添加無菌上清液對S.putrefaciens在4 ℃ 貯藏中TVB-N形成的影響

Figure 4 Effect of CFS on total volatile basic nitrogen contents ofS.putrefacienscultured in BHI broth at 4 ℃

2.5 總氨基酸變化

表1列出了在4 ℃貯藏下，分別添加50 mL/100 mL的P.fluorescens、A.hydrophila和A.sobria無菌上清液對S.putrefaciens氨基酸的影響。有機體蛋白質(zhì)組織的基本成分是氨基酸，其在生物體的生命活動中發(fā)揮著非常重要的作用[26]。結(jié)果表明，SP組、SH組和SW組中Lys含量由初始值的342.88，290.14，344.71 μg/mL分別降低到243.47，260.09，285.43 μg/mL，降低率分別為28.99%，10.36%，17.20%，Glu由初始值的777.70，650.47，786.67 μg/mL分別降低到528.53，567.44，626.02 μg/mL，降低率分別為32.04%，12.76%，20.42%。氨基酸為腐敗菌的生長提供碳源和氮源，同時也是腐敗產(chǎn)物生物胺的前提物質(zhì)。對比SP組、SH組和SW組貯藏終點時氨基酸含量變化發(fā)現(xiàn)，SH組和SW組中氨基酸總量、Glu、Gly、Ala、Lys和Leu的降低率都低于CK組和SP組。從表1中還可以看出，與0 d相比，貯藏12 d后CK組、SP組、SH組和SW組中總氨基酸的含量分別降低了17.76%，28.41%，13.55%，14.84%。貯藏12 d后，與對照組相比，A.hydrophila和A.sobria的無菌上清液均能抑制S.putrefaciens對氨基酸的降解能力，而P.fluorescens無菌上清液則起促進作用。

2.6 腐胺變化

S.putrefaciens可以使高蛋白的水產(chǎn)品中鳥氨酸、賴氨酸和組氨酸發(fā)生脫羧作用生成腐胺、尸胺和少量組胺[13,27]，隨著貯藏時間的延長，微生物產(chǎn)生的腐胺含量增加，產(chǎn)生有害物質(zhì)導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗。在低溫貯藏下，腐胺是S.putrefaciens代謝產(chǎn)生的最主要的生物胺[28]。圖5是在4 ℃貯藏下，分別添加50 mL/100 mLP.fluorescens、A.hydrophila和A.sobria無菌上清液對S.putrefaciens產(chǎn)生腐胺能力的影響。從圖5可以看出，隨著貯藏時間的延長，腐胺含量在逐漸上升，貯藏4 d后各組無菌上清液對S.putrefaciens產(chǎn)生腐胺的抑制率較低。但與對照組相比，貯藏8 d后，P.fluorescens和A.sobria無菌上清液對S.putrefaciens產(chǎn)生腐胺的抑制率分別為7.54%，33.96%，貯藏12 d后，P.fluorescens和A.sobria無菌上清液對S.putrefaciens產(chǎn)生腐胺的抑制率分別為2.66%，29.33%。表明當S.putrefaciens生長至穩(wěn)定期后，A.sobria無菌上清液對腐胺產(chǎn)生的抑制率最高，可能是A.sobria無菌上清液可以抑制S.putrefaciens代謝產(chǎn)生脫羧酶，抑制其生成腐胺。

表1 BHI培養(yǎng)液中添加無菌上清液對S. putrefaciens在4 ℃貯藏中氨基酸的影響?Table 1 Effect of CFS on total amino acid contents of S. putrefaciens cultured in BHI broth at 4 ℃ (n=3) μg/mL

? Cys、Pro、Asn、Gln和Trp在樣品處理時被破壞。

圖5 BHI培養(yǎng)液中添加無菌上清液對S.putrefaciens在4 ℃ 貯藏中腐胺形成的影響

Figure 5 Effect of CFS on putrescine content ofS.putrefacienscultured in BHI broth at 4 ℃

3 結(jié)論

本試驗主要研究了P.fluorescens、A.hydrophila和A.sobria的胞外產(chǎn)物在4 ℃下對S.putrefaciens的生長和致腐敗能力的影響。通過菌落總數(shù)、胞外蛋白酶和生物膜的分析發(fā)現(xiàn)只有A.sobria的無菌上清液對S.putrefaciens的生長有抑制作用。通過分析S.putrefaciens的腐敗產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)P.fluorescens、A.hydrophila的無菌上清液對S.putrefaciens的抑制作用較小，A.sobria能顯著抑制S.putrefaciens的致腐敗能力，說明A.sobria的胞外產(chǎn)物中含有抑制S.putrefaciens生長的群體感應(yīng)信號分子，但是具體起作用的化合物是哪些仍需要進一步研究確認。