張振科，楊方玉，樊建輝，李建民，吳衛(wèi)光

（河南仰韶酒業(yè)有限公司，河南澠池472400）

大曲是由小麥、大麥、豌豆按照一定的比例，自然接種、人工控溫培育，含有豐富的微生物與多種酶類的塊狀制劑[1]。目前一般根據(jù)大曲培養(yǎng)工藝不同，將大曲分為高溫大曲、中高溫大曲以及中溫大曲[2]。大曲在白酒釀造中主要提供發(fā)酵力、糖化力、液化力以及釀造微生物，并提供決定酒體風格的呈香呈味的前驅(qū)物質(zhì)[3]。在白酒行業(yè)中，一直流傳著“曲是酒之骨”“有好曲就有好酒”這兩句話，由此可知大曲的質(zhì)量對白酒生產(chǎn)的重要性，為了提高大曲質(zhì)量，許多白酒科研工作者對大曲進行了大量研究工作。申孟林等[4]對大曲中微生物的分類以及作用進行了詳細的研究；朱文優(yōu)等[5]采用高通量測序技術(shù)和多元統(tǒng)計法對不同季節(jié)的高溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)以及演變進行了系統(tǒng)的研究；楊丹丹等[6]利用紫外誘變技術(shù)獲得一株高產(chǎn)糖化力的黑曲霉；熊翔等[7]對大曲工藝研究發(fā)現(xiàn)，當小麥粉碎度57%、鮮曲含水量39%時，大曲質(zhì)量最優(yōu)。

目前，有關(guān)大曲質(zhì)量提升的研究，主要是在菌種選育和大曲培育工藝兩大方向[8-10]。大曲曲皮厚度直接影響著大曲的質(zhì)量，趙迎路等[13]對不同季節(jié)和不同原料兩個方面對大曲的曲皮質(zhì)量問題做了科學的研究；霍永建[14]對汾酒大曲曲皮的各種質(zhì)量問題做了詳細的總結(jié)概述；明紅梅等[15]對瀘型大曲研究發(fā)現(xiàn)，曲皮的理化指標直接影響著大曲的整體質(zhì)量；而有關(guān)曲皮厚度對大曲質(zhì)量的影響還沒有相關(guān)研究報道。本次通過研究曲皮厚度對大曲質(zhì)量的影響，來進一步提升大曲質(zhì)量，以便為大曲生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品及試劑

樣品：未經(jīng)培育的大曲（仰韶酒廠提供）。

試劑：磷酸二氫鉀、硫酸鎂、蔗糖、磷酸銨、無水乙酸鈉、冰乙酸、可溶性淀粉、重鉻酸鉀、葡萄糖、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、碘化鉀、碘、次甲基藍、甲基藍、酒石酸甲鈉、硫酸銅、胰蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、納他霉素、瓊脂粉、蛋白胨、酵母粉、氨芐青霉素、維生素B1，購于上海生工，均為AR級。

1.1.2 儀器設(shè)備

電熱干燥箱、蒸發(fā)皿、分析天平、容量瓶、滴定管、移液管、錐形瓶、燒杯、恒溫水浴鍋、玻璃棒、容量瓶、測量尺、滅菌鍋。

1.1.3 培養(yǎng)基

細菌培養(yǎng)基：葡萄糖15 g/L，胰蛋白胨5 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，納他霉素1 g/L，瓊脂粉12 g/L，pH 7.0。

酵母培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，豆芽200 g/L，氨芐青霉素1 g/L，瓊脂粉12 g/L，pH 6.0。

霉菌培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨 0.5 g/L，KH2PO45 g/L，MgSO4·7H2O 3 g/L，維生素B10.1 g/L，瓊脂粉12 g/L，氨芐青霉素1 g/L，自然pH值。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖80 g/L，磷酸銨1.25 g/L，磷酸二氫鉀1.25 g/L，自然pH值。

1.1.4 其他溶液

次甲基藍指示劑(10 g/L)：稱取1.0 g次甲基藍，加水溶解并定容至100 mL。

氫氧化鈉溶液(200 g/L)：稱取20.0 g氫氧化鈉，加適量水溶解，待冷卻后定容至100 mL。

斐林試劑甲液：稱取15.6 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）及0.05 g次甲基藍溶于蒸餾水中，并定容至1000 mL。

斐林試劑乙液：稱取50 g酒石酸鉀鈉及54 g氫氧化鈉溶于蒸餾水中，再加入4 g亞鐵氰化鉀，完全溶解后，用蒸餾水定容至1000 mL。

葡萄糖標準溶液(2.5 g/L)：稱取經(jīng)103～105℃烘干至恒重的無水葡萄糖2.5 g(精確至0.0001 g)，用水溶解，并定容至1000 mL。此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

碘液：稱取11.0 g碘、22.0 g碘化鉀，置于研缽中，加少量水研磨至碘完全溶解，用水稀釋定容至500 mL，為原碘液，貯存于棕色瓶中。使用時，吸取2.0 mL，加20.0 g碘化鉀，用水溶解定容至500 mL，為稀碘液，貯存于棕色瓶中。

pH4.6乙酸-乙酸鈉緩沖液：2 mol/L冰乙酸：取118 mL冰乙酸用水稀釋至1000 mL；2 mol/L乙酸鈉：稱取272 g乙酸鈉（CH3COONa·3H2O）溶于水，稀釋至1000 mL。將兩溶液等體積混合，即為醋酸-醋酸鈉緩沖液，緩沖溶液的pH值應(yīng)以酸度計校正。

20 g/L可溶性淀粉溶液：用分析天平準確稱取100～105℃干燥2 h的可溶性淀粉2 g（精確到0.001 g），于50 mL燒杯中用少量水調(diào)勻后，倒入盛有70 mL沸水的150 mL燒杯中，并用20 mL水洗凈50 mL小燒杯，洗液合并其中，用微火煮沸至透明，冷卻后用水定容至100 mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 大曲實驗室培養(yǎng)

取車間制作好的大曲，每次實驗平行3次，置于生化培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)箱設(shè)置條件：起始溫度28℃，以2℃/d的條件保持升溫7 d，升溫到42℃，保持5 d，再以2℃/d的條件保持升溫7 d，升溫到頂火56℃，頂溫保持5 d，以3℃/d的條件保持降溫7 d，降到溫度35℃，保持5 d；發(fā)酵周期為36 d，確保大曲在實驗室培養(yǎng)箱中發(fā)酵條件和周期與生產(chǎn)車間保持一致。為確保達到不同厚度的曲皮（≤0.5 cm、0.5～0.8 cm、0.8～1.2 cm、1.2～1.5 cm、≥1.5 cm），以及大曲質(zhì)量，培養(yǎng)過程注意事項：前期培養(yǎng)箱濕度控制在95%左右，培養(yǎng)時間3～8 d，即可達到不同曲皮厚度的范圍（0.2～1.4 cm），培養(yǎng)8～14 d時，培養(yǎng)箱濕度控制在80%左右，培養(yǎng)14 d后，培養(yǎng)箱濕度控制在40%～70%之間，每天都打開培養(yǎng)箱排水分與空氣交換5 min。

1.2.2 大曲固體浸出液制備

根據(jù)測得大曲試樣的水分，稱取相當于絕干試樣量5 g，精確至0.001 g，放入250 mL燒杯中，加10 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，再加水，用玻璃棒攪拌均勻，定容至100 mL。將上述燒杯置于35℃恒溫水浴中保溫浸漬1 h，保溫期間每間隔15 min攪拌1次。使用脫脂棉過濾，收集濾液，備用。

1.2.3 大曲理化指標的測定方法[11]

1.2.3.1 糖化力測定

（1）吸取25 mL 20 g/L淀粉溶液于50 mL容量瓶中，加pH4.6的緩沖溶液5 mL，將容量瓶于35℃水浴中保溫10 min，加5.00 mL固體曲浸出液，立即混勻計時，35℃水浴中保溫60 min，迅速加入15 mL 0.1 moL/L的NaOH溶液，終止酶解反應(yīng)。冷卻至室溫后，用水定容至50 mL，搖勻，得到糖化液。（2）同時作一空白試驗：吸取25 mL 20 g/L淀粉溶液，置于50 mL容量瓶中，加pH4.6緩沖溶液5 mL。先加入15 mL 0.1 moL/L的NaOH溶液，再準確加入5.00 mL曲浸出液，用水定容至50 mL，搖勻。（3）吸取斐林試劑甲液、乙液各5 mL于150 mL三角瓶中，加入5 mL制備好的糖化液，用滴定管加入一定量1.0 g/L葡萄糖標準溶液（使隨后滴定時其用量不超過1 mL），置電爐上加熱煮沸2 min，在沸騰狀態(tài)下繼續(xù)滴加葡萄糖標準溶液至藍色消失而呈淡黃色，記錄葡萄糖標準溶液的總用量。后面的滴定操作應(yīng)在1 min內(nèi)完成。同時作一空白試驗。（4）空白試驗取斐林試劑甲液、乙液各5 mL于三角瓶中，加入5 mL制備好的空白液，以下操作同試樣操作。

固體曲糖化力的定義為：在35℃，pH4.6時，1 g絕干曲1 h內(nèi)酶解可溶性淀粉為葡萄糖的質(zhì)量。其計算公式為：

式中：X為糖化力，mg葡萄糖/g曲·h；V0為空白試驗葡萄糖標準溶用量，mL；V為試樣測定葡萄糖標準溶液用量，mL；ρ為葡萄糖標準溶液濃度，g/mL；ms為以絕干曲計的試樣稱取量，5.00 g；t為酶解時間，h；結(jié)果保留整數(shù)。

1.2.3.2 液化力測定

吸取25.0 mL 20.0 g/L可溶性淀粉和5 mL的pH4.6緩沖溶液于100 mL試管中，于35℃水浴中保溫10 min后，加入5.0 mL試樣浸出液，充分搖勻，立即計時。繼續(xù)于35℃保溫，定時取出1滴反應(yīng)液于加有碘液的白磁點滴板空穴內(nèi)，觀察變色情況。當?shù)庖侯伾辉俑淖儠r即為反應(yīng)終點，立即記錄液化時間。

固體曲液化力的定義為：在35℃，pH4.6時，1 g絕干曲液化可溶性淀粉的質(zhì)量。其計算公式為：

式中：X為液化力，g淀粉/g曲·h；25.0為可溶性淀粉溶液用量，mL；0.020為可溶性淀粉溶液濃度，g/mL；0.25為5 mL浸出液相當于絕干曲計的試樣量，g；t為液化時間，min；結(jié)果保留小數(shù)點后2位。

1.2.3.3 發(fā)酵力測定

用移液管吸取發(fā)酵培養(yǎng)液50 mL于150 mL三角瓶中，塞上棉塞，外包油紙，在0.1 MPa壓力下蒸汽滅菌30 min。然后，在無菌條件下，向三角瓶內(nèi)接入相當于1.0 g絕干曲的曲粉，稱量并記錄發(fā)酵培養(yǎng)前三角瓶和內(nèi)容物的總質(zhì)量。之后將三角瓶置于培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)72 h。其中每8 h稱量1次。每次稱量前輕輕搖動使二氧化碳逸出。如此反復稱量直至衡量為止，即發(fā)酵完畢。

發(fā)酵力指1 g絕干曲在上述規(guī)定條件下，發(fā)酵糖化液產(chǎn)生二氧化碳的質(zhì)量。其計算公式為：

式中：X為發(fā)酵力，g CO2/g曲；m1為發(fā)酵之前發(fā)酵瓶和內(nèi)容物總質(zhì)量，g；m2為發(fā)酵完畢發(fā)酵瓶和內(nèi)容物總質(zhì)量，g；m為絕干曲的接入試樣質(zhì)量，g；結(jié)果保留到小數(shù)點后2位。

1.2.4 大曲微生物菌落的培養(yǎng)

稱取適量的大曲，將其徹底粉碎，溶于無菌水中，采用梯度稀釋法，將預培養(yǎng)樣品分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，吸取每一梯度樣品1 mL分別涂布于酵母培養(yǎng)基、細菌培養(yǎng)基以及霉菌培養(yǎng)基，選擇合適稀釋倍數(shù)的稀釋液，每個稀釋度做3個平行。細菌分離培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)3 d，酵母和霉菌分離培養(yǎng)基置于28℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，分別統(tǒng)計記錄菌落總數(shù)[12]。

1.2.5 驗曲小組對不同厚度曲皮大曲感官評比

將實驗室培養(yǎng)不同厚度曲皮的大曲分類，在不參考不同厚度大曲理化指標前提下，由酒廠驗曲小組5名成員對大曲整體感官打分評比，評分滿分50分，評分越高大曲感官質(zhì)量越好。

2 結(jié)果與分析

2.1 曲皮厚度對液化力的影響

將實驗室培養(yǎng)的同一曲皮厚度范圍內(nèi)大曲粉碎，制備出大曲固體浸出液，按照液化力測定方法測定不同曲皮厚度的液化力，結(jié)果見圖1。曲皮厚度在1.2～1.5 cm之間時，大曲液化力達到最大值，為2.2 g淀粉/g曲·h；當大曲曲皮厚度小于0.5 cm時，液化力的平均值只有0.8 g淀粉/g曲·h；曲皮厚度大于1.5 cm時，液化力平均值為2.1 g淀粉/g曲·h。隨著曲皮厚度的增加，大曲液化力也隨著變強，但是大曲曲皮變厚的同時大曲的火圈也會加重，所以曲皮大于1.5 cm后，大曲的液化力沒有再增強，反而有一定的變?nèi)酢?/p>

圖1 曲皮厚度與液化力關(guān)系

2.2 曲皮厚度對糖化力的影響

將實驗室培養(yǎng)的同一曲皮厚度范圍內(nèi)大曲粉碎，制備出大曲固體浸出液，按照糖化力測定方法測定不同曲皮厚度的糖化力，結(jié)果見圖2。曲皮厚度在1.2～1.5 cm之間時，大曲糖化力達到最大值，為1170 mg葡萄糖/g曲·h；當大曲曲皮厚度小于0.5 cm時，糖化力的平均值只有550 mg葡萄糖/g曲·h；曲皮厚度在0.5～0.8 cm時，糖化力平均值為820 mg葡萄糖/g曲·h；曲皮厚度在0.8～1.2 cm時，糖化力平均值為980 mg葡萄糖/g曲·h；曲皮厚度大于1.5 cm時，糖化力平均值為1010 mg葡萄糖/g曲·h。隨著曲皮厚度的增加，大曲糖化力也隨著變強，但是大曲曲皮變厚的同時大曲的火圈也會加重，霉菌再往大曲內(nèi)部生長變得困難，所以曲皮厚度大于1.5 cm以后，大曲的糖化力沒有再增強，反而有一定的變?nèi)酢?/p>

圖2 曲皮厚度與糖化力關(guān)系

2.3 曲皮厚度對發(fā)酵力的影響

將實驗室培養(yǎng)的同一曲皮厚度范圍內(nèi)大曲粉碎，制備出大曲固體浸出液，按照發(fā)酵力測定方法測定不同曲皮厚度的發(fā)酵力，結(jié)果見圖3。當大曲曲皮厚度小于0.5 cm時，發(fā)酵力的平均值為1.4 g CO2/g曲；曲皮厚度在0.5～0.8 cm時，發(fā)酵力平均值為1.5 g CO2/g曲；曲皮厚度在0.8～1.2 cm時，發(fā)酵力平均值為1.6 g CO2/g曲；曲皮厚度在1.2～1.5 cm之間，大曲發(fā)酵力為1.5 g CO2/g曲；曲皮厚度大于1.5 cm時，發(fā)酵力平均值為1.6 g CO2/g曲。隨著曲皮厚度的增加，大曲發(fā)酵力并沒有變化，可能與酵母菌的生長繁殖習性有關(guān)，因為酵母菌主要繁殖方式是芽殖和裂殖，在大曲培養(yǎng)過程中酵母菌很難往大曲內(nèi)部生長，主要分布在大曲的曲皮最外邊，所以大曲發(fā)酵力大小受曲皮厚度的影響不大。

2.4 曲皮厚度對微生物的影響

2.4.1 曲皮厚度對霉菌的影響

圖3 曲皮厚度與發(fā)酵力關(guān)系

將實驗室培養(yǎng)的同一曲皮厚度范圍內(nèi)大曲粉碎，按照微生物菌落培養(yǎng)方法，結(jié)果見圖4。由圖4可知：當曲皮厚度在1.2～1.5 cm時，霉菌菌落數(shù)達到最大值，為8.6×104cfu/g；曲皮厚度小于0.5 cm時，霉菌菌落數(shù)為4.2×104cfu/g；曲皮厚度在0.5～0.8 cm時，霉菌菌落數(shù)為5.9×104cfu/g；曲皮厚度在0.8～1.2 cm時，霉菌菌落數(shù)為7.1×104cfu/g；曲皮厚度大于1.5 cm時，霉菌菌落數(shù)為8.3×104cfu/g。隨著曲皮厚度的增加，大曲霉菌菌落數(shù)呈先增加再減少的過程，這個過程與大曲的液化力、糖化力變化一致。

圖4 曲皮厚度與霉菌菌落關(guān)系

2.4.2 曲皮厚度對酵母菌的影響

將實驗室培養(yǎng)的同一曲皮厚度范圍內(nèi)大曲粉碎，按照微生物菌落培養(yǎng)方法，結(jié)果見圖5。

在大曲培養(yǎng)過程中，曲皮厚度變化對酵母菌菌落數(shù)沒有影響，這與酵母菌的繁殖方式有關(guān)，大曲內(nèi)部酵母菌很少，主要是分布在曲皮表面。曲皮厚度小于0.5 cm時，酵母菌菌落數(shù)為4.3×105cfu/g；曲皮厚度在0.5～0.8 cm時，酵母菌菌落數(shù)為4.62×105cfu/g；曲皮厚度在0.8～1.2 cm時，酵母菌菌落數(shù)為5.6×105cfu/g；曲皮厚度在1.2～1.5 cm之間時，大曲酵母菌菌落數(shù)為5.3×105cfu/g；曲皮厚度大于1.5 cm時，酵母菌菌落數(shù)為5.8×105cfu/g。

圖5 曲皮厚度與酵母菌菌落關(guān)系

2.4.3 曲皮厚度對細菌的影響

將實驗室培養(yǎng)的同一曲皮厚度范圍內(nèi)大曲粉碎，按照微生物菌落培養(yǎng)方法，結(jié)果見圖6。當大曲曲皮厚度小于0.5 cm時，細菌菌落數(shù)為2.34×106cfu/g；曲皮厚度在0.5～0.8cm時，細菌菌落數(shù)為2.36×106cfu/g；曲皮厚度在0.8～1.2cm時，細菌菌落數(shù)為2.3×106cfu/g；曲皮厚度在1.2～1.5 cm之間時，大曲細菌菌落數(shù)為2.7×106cfu/g；曲皮厚度大于1.5 cm時，細菌菌落數(shù)為2.4×106cfu/g。

圖6 曲皮厚度與細菌菌落關(guān)系

2.5 大曲感官驗證評比結(jié)果

不同厚度曲皮感官評比結(jié)果見表1，由表1可知，大曲厚度在0.5～0.8 cm時，大曲評比得分最高。

3 結(jié)論

大曲曲皮厚度≤0.5 cm時，大曲液化力為0.8 g淀粉/g曲·h，糖化力為550 mg葡萄糖/g曲·h，發(fā)酵力為1.4 g CO2/g曲，霉菌菌落數(shù)為4.2×104cfu/g，酵母菌落數(shù)為4.3×105cfu/g，細菌菌落數(shù)為2.34×106cfu/g，大曲感官評分46.6分。

表1 大曲感官驗證評比結(jié)果

大曲曲皮厚度為0.5～0.8cm時，大曲液化力為1.6 g淀粉/g曲·h，糖化力為820 mg葡萄糖/g曲·h，發(fā)酵力為1.5 g CO2/g曲，霉菌菌落數(shù)為5.9×104cfu/g，酵母菌落數(shù)為4.62×105cfu/g，細菌菌落數(shù)為2.36×106cfu/g，大曲感官評分49.5分。

大曲曲皮厚度為0.8～1.2 cm時，大曲液化力為1.9 g淀粉/g曲·h，糖化力為980 mg葡萄糖/g曲·h，發(fā)酵力為1.6 g CO2/g曲，霉菌菌落數(shù)為7.1×104cfu/g，酵母菌落數(shù)為5.6×105cfu/g，細菌菌落數(shù)為2.3×106cfu/g，大曲感官評分48.7分。

大曲曲皮厚度為1.2～1.5 cm時，大曲液化力為2.2 g淀粉/g曲·h，糖化力為1170 mg葡萄糖/g曲·h，發(fā)酵力為1.5 g CO2/g曲，霉菌菌落數(shù)為8.6×104cfu/g，酵母菌落數(shù)為5.3×105cfu/g，細菌菌落數(shù)為2.7×106cfu/g，大曲感官評分47.1分。

大曲曲皮厚度≥1.5 cm時，大曲液化力為2.1 g淀粉/g曲·h，糖化力為1010 mg葡萄糖/g曲·h，發(fā)酵力為1.6 g CO2/g曲，霉菌菌落數(shù)為8.3×104cfu/g，酵母菌落數(shù)為5.8×105cfu/g，細菌菌落數(shù)為2.4×106cfu/g，大曲感官評分46.1分。

綜合本單位優(yōu)質(zhì)大曲理化指標要求（液化力大于1.5 g淀粉/g曲·h，糖化力大于700 mg葡萄糖/g曲·h，發(fā)酵力大于1.2 g CO2/g曲，大曲感官評分高于45分）和生產(chǎn)車間實際管理成效，大曲曲皮厚度應(yīng)該控制在0.5～0.8 cm之間。