林明，姜路花，余挺,*

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，杭州 310058；2.淳安縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，杭州 311700）

果實(shí)在存貯及轉(zhuǎn)運(yùn)過程中由采后病害造成的損失巨大[1]，其中擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）被普遍認(rèn)為是梨病害的主要病原菌[2-3]。現(xiàn)階段，主要采用化學(xué)殺菌劑來防治該病害，然而過度使用化學(xué)殺菌劑會危害人體健康，造成環(huán)境污染及產(chǎn)生抗藥性等問題[4]。當(dāng)前，歐盟已禁止化學(xué)殺菌劑在核果類果實(shí)中的應(yīng)用[5]，因此，尋找安全無毒、環(huán)境友好和高效抑菌的化學(xué)殺菌劑替代品已成為現(xiàn)階段的迫切需求[6]。將拮抗微生物用于果實(shí)采后病害的生物防治被視為最有可能替代化學(xué)殺菌劑的方法之一[1]。拮抗酵母具有安全無毒、使用方便及遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，使其商品化運(yùn)用成為可能。目前，國際上已有多種拮抗酵母的生物防治微生物制品獲準(zhǔn)注冊生產(chǎn)，包括 Nexy、AQ10、Shemer及 Sporodex等[7-9]。為進(jìn)一步提高拮抗酵母的生物防治效果，研究人員進(jìn)行了多種嘗試，包括逆境脅迫處理、培養(yǎng)條件優(yōu)化、分離逆境條件拮抗菌種及表達(dá)外源基因等[3，10-12]。其中，隨著分子技術(shù)的高速發(fā)展，將表達(dá)產(chǎn)物具有直接抑菌效力及能提高拮抗微生物抗逆性等外源基因定向轉(zhuǎn)化拮抗酵母，逐漸成為生物防治領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。畢赤酵母具有遺傳操作簡單、外源基因表達(dá)水平高且穩(wěn)定、表達(dá)產(chǎn)物可加工及修飾等特點(diǎn)受到研究者青睞，目前已有多種抗菌肽在畢赤酵母中成功表達(dá)。BANANI等[13]將堿性絲氨酸蛋白酶基因轉(zhuǎn)化到畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，誘導(dǎo)表達(dá)后能有效抑制蘋果4種采后病原真菌的致病性。KUDDUS等[14]報(bào)道，將抗菌肽基因snakin-1轉(zhuǎn)化畢赤酵母能有效抑制革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及假絲酵母等的生長。

抗菌肽是生物體特定基因編碼產(chǎn)生的一類具有抑菌作用的小分子多肽，對細(xì)菌具有高效光譜的殺滅能力，同時(shí)對真菌、病毒、原蟲等也具有較強(qiáng)抑制作用[15-16]?？咕脑诠卟『Ψ乐畏矫娴膽?yīng)用前景廣闊，微摩爾級即可有效地抑制病原菌，同時(shí)不易產(chǎn)生耐藥性等特性使得抗菌肽的作用日益突出。如：ZHANG等[17]發(fā)現(xiàn)，從枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）培養(yǎng)基中提取胰蛋白酶水解產(chǎn)物的多肽能有效抑制葡萄的腐?。籐IU等[18]經(jīng)體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn)，CgPep33抗菌肽能有效地抑制草莓中灰葡萄孢的孢子萌發(fā)。然而受限于現(xiàn)階段技術(shù)水平的落后，直接提取抗菌肽存在難度大、成本高、提取率低等劣勢，以及許多天然抗菌肽會存在輕微的細(xì)胞毒性和溶血活性等安全問題，從而限制了抗菌肽的大規(guī)模使用。

本研究所選擇的抗菌肽Ace-AMP1具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性，沸水浴10 min后仍具有活性；Ace-AMP1對多種采后病原微生物具有高效的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，Ace-AMP1對12種測試的真菌均具有抑制效果，其中對鏈格孢菌（Alternaria brassicola）的半抑制質(zhì)量濃度（50%inhibiting concentration,IC50）低至 2.5 μg/mL，對灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的半抑制質(zhì)量濃度（IC50）低至3 μg/mL，同時(shí)，人體細(xì)胞溶血活性測定結(jié)果證實(shí)Ace-AMP1對人體細(xì)胞不具有毒性[19-20]。本研究根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性對Ace-AMP1抗菌肽目的基因進(jìn)行優(yōu)化，并將其構(gòu)建到pPICZα A表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115高效表達(dá)，以期能夠得到高效表達(dá)Ace-AMP1的重組菌株及提高重組酵母在采后病害防治上的效果，為抗菌肽在抑制果實(shí)采后病害的開發(fā)利用方面奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用水果為成熟度相近、大小相等、無明顯受損和無病害的，采摘于商業(yè)成熟期的水晶梨（Pyrus pyrifolia）。在實(shí)驗(yàn)開始前，水晶梨先用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的次氯酸鈉溶液漂洗1 min，然后再用自來水沖洗干凈，自然晾干后置于相同處理過的塑料筐中，備用。

表達(dá)載體pPICZα A及GS115酵母菌株購買于美國Invitrogen公司；大腸埃希菌菌株DH5α購買于南京諾唯贊（Vazyme）生物科技有限公司；青霉病病原菌（Penicillium expansum）為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、NotⅠ、SacⅠ及T4連接酶購買于英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；PCR試劑2×Phanta Max Master Mix購買于南京諾唯贊（Vazyme）生物科技有限公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒均購買于美國Axygen公司；博來霉素購買于上海翊圣生物科技有限公司；一抗c-Myc Tag單克隆抗體購買于美國Invitrogen公司；二抗以辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（H+L）購買于上海碧云天公司。胰蛋白胨、酵母提取物等其他試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的合成

為保證目的基因N端的天然活性，并根據(jù)表達(dá)載體序列信息，在目的基因前端序列添加Kex2酶切位點(diǎn)；同時(shí)根據(jù)畢赤酵母GS115密碼子偏好性，對Ace-AMP1序列進(jìn)行改造，在改造后的序列Kex2酶切位點(diǎn)前端添加XhoⅠ和NotⅠ作為限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，優(yōu)化后的目的基因序列委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并將合成序列連接至pUC-SP載體上。

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將含有優(yōu)化目的基因的pUC-SP載體和表達(dá)載體pPICZα A分別用XhoⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，所得產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并用DNA凝膠回收試劑盒回收優(yōu)化后的目的片段和表達(dá)載體。將回收后的目的片段通過T4連接酶構(gòu)建到pPICZα A質(zhì)粒上，并將構(gòu)建好的載體導(dǎo)入DH5α大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)45 min，然后涂布于低鹽的LB+博來霉素平板（博來霉素質(zhì)量濃度為25 μg/mL）上，37℃過夜培養(yǎng)至形成單菌落，最后分別挑取單菌落進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）檢測及后續(xù)測序鑒定。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；最后，72℃延伸5 min。5′AOX1特異性引物為：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′。3′AOX1特異性引物為：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′。構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體命名為pPICZα A/Ace-AMP1，并用于下一步轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 重組GS115/Ace-AMP1酵母的轉(zhuǎn)化與鑒定

將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pPICZα A/Ace-AMP1和未導(dǎo)入抗菌肽的空載體pPICZα A用SacⅠ酶切處理后，取10 μL線性化的載體與80 μL制備好的GS115感受態(tài)細(xì)胞混勻并轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中，根據(jù)Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀設(shè)置的程序電擊轉(zhuǎn)化至感受態(tài)酵母細(xì)胞內(nèi)，迅速添加1 mol/L山梨醇1 mL，28℃靜置1 h，取200 μL電擊轉(zhuǎn)化液均勻涂布于YPD+博來霉素抗性平板（博來霉素質(zhì)量濃度為100 μg/mL）上，并于28℃恒溫條件下培養(yǎng)至形成單菌落。分別挑取單菌落進(jìn)行酵母基因組的提取，并將其作為反應(yīng)模板，引物、PCR反應(yīng)體系與條件同1.2.2。將目的基因已正確整合到酵母基因組的重組轉(zhuǎn)化菌株命名為GS115/Ace-AMP1，空載體轉(zhuǎn)化菌株命名為GS115/pPICZαA。

1.2.4Ace-AMP1在酵母中的表達(dá)與鑒定

挑取經(jīng)過驗(yàn)證的目的基因已整合到酵母基因組的重組菌株GS115/Ace-AMP1和空質(zhì)粒對照菌株GS115/pPICZα A單菌落，于25 mL BMGY液體培養(yǎng)基中以30℃、250 r/min振蕩過夜培養(yǎng)；離心收集菌體沉淀，用BMMY液體培養(yǎng)基重懸菌液至D（600 nm）=1.0，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。每隔24 h添加甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為1%，持續(xù)誘導(dǎo)120 h；每隔12 h取1 mL樣品測定抗菌肽表達(dá)水平。

將樣品以8 000g離心10 min，分別收集上清液和沉淀，每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)取50 μL上清液，用Braford法檢測樣品中的抗菌肽濃度。同時(shí)，將得到的上清液按照9∶1的比例加入100%三氯乙酸，混勻后置于冰上沉淀過夜，離心后加入預(yù)冷的丙酮振蕩重懸，再次離心后加入十二烷基磺酸鈉樣品緩沖液重懸，沸水浴處理10 min，取10 μL樣品進(jìn)行Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE），電泳后的凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜處理，然后加入Western封閉液緩慢搖動(dòng)，室溫封閉1 h后進(jìn)行一抗和二抗孵育，最后進(jìn)行蛋白檢測。

將沉淀用無菌水清洗2遍，加入Yeast RNAprep Buffer試劑去除酵母細(xì)胞壁，然后在RNAiso試劑（RNAiso Plus）的作用下裂解細(xì)胞，釋放核酸，再分別加入三氯甲烷和異丙醇提取酵母RNA，最后用75%乙醇對RNA進(jìn)行清洗。得到的RNA用PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并將其作為實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-timequantitativepolymerase chain reaction,RT-qPCR）模板，采用2－ΔΔCT方法定量檢測Ace-AMP1抗菌肽基因表達(dá)量。定量用特異性引物為內(nèi)參基因引物GS115Actin（F：5′-GGTTCCCACTTATTTCCCAG-3′；R：5′-GCTCCTTCAGTTTTTCCGTCT-3′），抗菌肽基因引物為Ace-AMP1（F：5′-CCTGTAGATGTTTGG TAGGGG-3′；R：5′-GCATTGAATACGGGGACG-3′）。

1.2.5 重組GS115/Ace-AMP1酵母生物防治效果檢測

重組轉(zhuǎn)化株GS115/Ace-AMP1、對照菌株GS115/pPICZα A及畢赤酵母GS115在酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium,YPD）上活化2代，然后按照上述方法誘導(dǎo)培養(yǎng)后，離心收集菌體沉淀，用無菌水充分重懸洗滌菌體2次，最后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整菌懸液至1×107mL－1。

將本實(shí)驗(yàn)室低溫保存的擴(kuò)展青霉病原菌活化2代，然后轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium,PDA）上，28℃恒溫培養(yǎng)至形成孢子，用經(jīng)過無菌處理的接種環(huán)刮取適量分生孢子于無菌水中，最后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整分生孢子懸液至1×104mL－1。

實(shí)驗(yàn)用水晶梨先經(jīng)0.1%次氯酸鈉溶液漂洗，再用自來水沖洗干凈，自然晾干，備用。每個(gè)果實(shí)用無菌處理的打孔器在赤道部位制造4個(gè)傷口，每個(gè)傷口盡量保持寬5 mm、深5 mm。分別往傷口中添加50 μL無菌水（CK）、1×107mL－1的GS115菌懸浮液、1×107mL－1的 GS115/pPICZα A 菌懸浮液、1×107mL－1的GS115/Ace-AMP1菌懸浮液。自然晾干2 h后，每個(gè)傷口接種30 μL 1×104mL－1的青霉病原孢子懸浮液。選取9個(gè)梨果實(shí)作為一個(gè)處理置于飼料框中，用保鮮膜封口，保持90%的濕度環(huán)境，25℃恒溫貯藏48 h后觀察并記錄果實(shí)的發(fā)病率及病斑直徑。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

2 結(jié)果

2.1 Ace-AMP1目的基因優(yōu)化及合成

以在APD（Antimicrobial Peptide Database）數(shù)據(jù)庫中得到的Ace-AMP1抗菌肽作為母體肽，根據(jù)畢赤酵母GS115密碼子偏好性對Ace-AMP1進(jìn)行優(yōu)化并合成，合成產(chǎn)物連接到pUC-SP載體上，測序驗(yàn)證后表明，XhoⅠ、NotⅠ、Kex2酶切位點(diǎn)及Ace-AMP1目的基因已正確連接。

2.2 pPICZα A/Ace-AMP1重組表達(dá)載體的構(gòu)建

雙酶切后的線性化載體和Ace-AMP1經(jīng)切膠回收，并用T4連接酶過夜連接。構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌，挑取單菌落經(jīng)PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示：有4個(gè)單菌落出現(xiàn)與理論值一致的單一條帶，2個(gè)單菌落pPICZα A載體沒有被完全切開。將與理論值一致的4個(gè)單菌落的PCR結(jié)果進(jìn)一步測序驗(yàn)證，結(jié)果表明，Ace-AMP1已正確構(gòu)建到pPICZαA表達(dá)載體上。

圖1 重組質(zhì)粒pPICZαA/Ace-AMP1的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Identification result of pPICZα A/Ace-AMP1 recombinant plasmid by PCR

2.3 重組載體的轉(zhuǎn)化和鑒定結(jié)果

重組表達(dá)載體pPICZα A/Ace-AMP1和未導(dǎo)入抗菌肽的空載體pPICZα A電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞后，均勻涂布于含有博來霉素的抗性平板上，分別挑取單菌落連同畢赤酵母GS115一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示：畢赤酵母GS115、導(dǎo)入空質(zhì)粒后的GS115及導(dǎo)入重組表達(dá)載體后的GS115均能在2 000 bp處檢測到條帶，說明所用的通用引物5′AOX1和3′AOX1能識別GS115基因組其他位點(diǎn)，但是只在導(dǎo)入空質(zhì)粒和導(dǎo)入抗菌肽重組質(zhì)粒的GS115畢赤酵母中出現(xiàn)大小不同、與預(yù)期相符的2條條帶，說明空載體pPICZα A和重組表達(dá)載體pPICZα A/Ace-AMP1已連接到GS115基因組中，進(jìn)一步經(jīng)測序驗(yàn)證表明結(jié)果正確。

圖2 重組菌株GS115/Ace-AMP1的PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Identification result of GS115/Ace-AMP1 recombinant strain by PCR

2.4 Ace-AMP1在酵母中的表達(dá)與鑒定結(jié)果

挑取誘導(dǎo)表達(dá)后的含抗菌肽重組基因的GS115和誘導(dǎo)表達(dá)后的僅含空質(zhì)粒的GS115測定抗菌肽表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示：誘導(dǎo)84 h后，導(dǎo)入Ace-AMP1組的蛋白質(zhì)量達(dá)到最大值，為109 μg/mL，而對照組則一直處于較低水平。

圖3 重組酵母GS115/Ace-AMP1的蛋白質(zhì)含量Fig.3 ProteincontentofGS115/Ace-AMP1recombinantstrain

每隔12 h取樣，經(jīng)RT-qPCR定量檢測誘導(dǎo)表達(dá)后的重組GS115/Ace-AMP1酵母中Ace-AMP1抗菌肽基因的表達(dá)量，結(jié)果如圖4所示：從12 h到108 h，抗菌肽Ace-AMP1基因均能上調(diào)表達(dá)，說明甲醇能顯著誘導(dǎo)目的基因表達(dá)；在72 h時(shí)，Ace-AMP1基因表達(dá)量達(dá)到最大值，為誘導(dǎo)前的5.4倍。

圖4 重組酵母GS115/Ace-AMP1的Ace-AMP1基因相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression amount of Ace-AMP1 for the recombinant strain GS115/Ace-AMP1

將取樣得到的上清液經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法（Western-blotting）檢測，結(jié)果如圖5所示：GS115畢赤酵母和導(dǎo)入空質(zhì)粒的GS115/pPICZα A畢赤酵母在膠體中不存在條帶，而導(dǎo)入抗菌肽后的重組GS115/Ace-AMP1畢赤酵母則存在一條分子質(zhì)量約為12.5 kDa的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明抗菌肽已成功導(dǎo)入畢赤酵母GS115中，并能夠成功表達(dá)。

圖5 重組菌株GS115/Ace-AMP1的蛋白質(zhì)印跡法鑒定結(jié)果Fig.5 Identification result of GS115/Ace-AMP1 recombinant strain by Western-blotting

2.5 重組GS115/Ace-AMP1酵母對梨青霉病的防治效果

將重組轉(zhuǎn)化株GS115/Ace-AMP1、對照菌株GS115/pPICZα A及畢赤酵母GS115誘導(dǎo)培養(yǎng)后，用調(diào)整到1×107mL－1的酵母菌懸液處理梨果實(shí)傷口，觀察其對青霉病的影響。結(jié)果（圖6A）表明，GS115/Ace-AMP1重組畢赤酵母能夠有效地抑制青霉病的發(fā)生，經(jīng)重組酵母GS115/Ace-AMP1懸浮液處理后的梨實(shí)驗(yàn)組，青霉病的發(fā)病率降低至41%，顯著低于對照組，而用無菌水、GS115及含空質(zhì)粒的GS115/pPICZα A酵母菌懸浮液處理后無顯著變化，發(fā)病率分別為75%、71%、71%。梨果實(shí)病斑直徑也具有相同的變化趨勢，重組酵母GS115/Ace-AMP1處理的實(shí)驗(yàn)組病斑直徑最小，僅為3.2 mm，相較于無菌水、GS115和導(dǎo)入空質(zhì)粒GS115/pPICZα A處理的對照組，病斑直徑分別下降65%、54%和61%（三者病斑直徑分別為9.4、7.0和8.2 mm）（圖6B）。青霉病發(fā)病率和病斑直徑的結(jié)果說明，導(dǎo)入抗菌肽Ace-AMP1后能顯著提高GS115的抑菌效果。

圖6 重組酵母GS115/Ace-AMP1對梨青霉病的防治效果Fig.6 Control efficiency of recombinant strain GS115/Ace-AMP1 on Penicillium expansum in pear fruit

3 討論

生物防治技術(shù)以其安全無毒、對環(huán)境友好、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)逐漸受到人們的重視。作為一種新型采后保鮮技術(shù)，其作用模式主要是利用微生物之間的營養(yǎng)與空間競爭，分泌水解酶、殺菌物質(zhì)和誘導(dǎo)果實(shí)產(chǎn)生抗性等來抑制病原微生物的生長，從而減小果蔬采后腐爛發(fā)生的概率[5，21-22]。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)以其遺傳穩(wěn)定、不產(chǎn)生毒素、自身分泌蛋白較少及能對異源基因進(jìn)行正確的翻譯、加工和修飾等優(yōu)點(diǎn)[13]，成為應(yīng)用最為廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。抗菌肽Ace-AMP1來自于可食性洋蔥種子，且已有研究證實(shí)對人體細(xì)胞無毒害作用，因而其安全性得到保障；同時(shí)，其對病原真菌的抑制效果達(dá)到微摩爾級，展現(xiàn)出在生物防治領(lǐng)域的巨大潛力。然而，天然抗菌肽生產(chǎn)成本高、提取工藝煩瑣等劣勢限制了其應(yīng)用與推廣，同時(shí)拮抗菌的生物防治效力與化學(xué)殺菌劑相比仍存在較大差距，因此，通過基因工程方法將抗菌肽導(dǎo)入拮抗菌中表達(dá)，以提高抗菌肽的產(chǎn)率，以及利用其高效抑菌能力，提高重組菌株的生物防治效力。本研究首次將Ace-AMP1轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中，獲得了高效表達(dá)抗菌肽Ace-AMP1且具有優(yōu)異抑菌效果的GS115/Ace-AMP1菌株，為該抗菌肽的大規(guī)模生產(chǎn)及抗菌肽在抑制果實(shí)采后病害的開發(fā)利用方面奠定了基礎(chǔ)。

將重組酵母GS115/Ace-AMP1誘導(dǎo)培養(yǎng)后，在84 h時(shí)取樣檢測發(fā)現(xiàn)，其蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度能達(dá)到109 μg/mL。而KUDDUS等[14]報(bào)道，將抗菌肽基因snakin-1轉(zhuǎn)化畢赤酵母后其提取量為40 μg/mL；任雪艷[23]將Cecropin A轉(zhuǎn)化畢赤酵母后其蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為14.247 μg/mL。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組酵母GS115/Ace-AMP1能高效表達(dá)抗菌肽Ace-AMP1，為抗菌肽的大規(guī)模生產(chǎn)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

將重組酵母GS115/Ace-AMP1用于梨采后的病害防治實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)：GS115畢赤酵母和轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒后GS115/pPICZα A畢赤酵母的發(fā)病率與無菌水處理的對照組相比沒有明顯的差異，而導(dǎo)入抗菌肽之后的重組GS115/Ace-AMP1畢赤酵母能顯著抑制梨青霉病的發(fā)生，發(fā)病率較無菌水處理組下降了34%；病斑直徑變化規(guī)律與發(fā)病率基本一致；然而，由于畢赤酵母與病原真菌之間存在拮抗作用，自身也具有一定的生物防治效力，因而GS115與對照組之間存在著明顯差異，但導(dǎo)入空質(zhì)粒之后，其病斑直徑與GS115無差異?？咕腁ce-AMP1作為能直接抑菌的物質(zhì)導(dǎo)入GS115后，使得重組酵母病斑直徑顯著減小65%。綜合發(fā)病率與平均病斑直徑的結(jié)果表明，導(dǎo)入抗菌肽Ace-AMP1后，重組GS115/Ace-AMP1畢赤酵母的生物防治效力得到提升。

目前，抗菌肽主要用于醫(yī)藥、食品和飼料添加劑等領(lǐng)域。SHAYKHIEV等[24]發(fā)現(xiàn)，LL-37能通過刺激呼吸道上皮細(xì)胞的增殖來加速傷口的愈合。FERREIRA等[25]發(fā)現(xiàn)，乳酸鏈球菌肽（nisin）能顯著降低干酪中產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）的數(shù)目，延長干酪的保質(zhì)期。但抗菌肽在果蔬采后病害防治領(lǐng)域的研究鮮有報(bào)道。本研究通過將抗菌肽導(dǎo)入拮抗酵母進(jìn)一步提高其生物防治效力的方法，能為果蔬采后病害新型生物防治技術(shù)的研究提供新思路和奠定理論基礎(chǔ)。

本研究仍存在一些不足：一是雖然所選的Ace-AMP1基因來源于可食性的洋蔥種子組織，且已被證實(shí)對人體細(xì)胞無毒害作用，同時(shí)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已被批準(zhǔn)作為一種動(dòng)物飼料添加劑[26]，但表達(dá)后的Ace-AMP1的安全性仍需進(jìn)一步探究；二是現(xiàn)階段抗菌肽的作用機(jī)制仍沒有得到統(tǒng)一，普遍認(rèn)為其依賴于與靶細(xì)胞膜的相互作用，使得膜通透性改變，打破酸堿平衡、滲透壓平衡等，而除了作用于細(xì)胞膜外，認(rèn)為其還能作用于胞內(nèi)靶標(biāo)，從而干擾細(xì)胞代謝[27]，因此，今后需進(jìn)一步探討導(dǎo)入抗菌肽后的重組酵母的相關(guān)抑菌機(jī)制。

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