何亞濤，高丹丹，甘森寧，孫婷，蔡葵蒸，劉俊林

（西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730124）

隨著人們對食品安全問題的普遍關注，綠色無公害的天然色素的使用便引起了人們的重視[1-2]。紅曲色素作為我國傳統(tǒng)的紅色天然食用色素，近些年來發(fā)現其不僅可用于食品染色，還具有抑制膽固醇合成、降低血壓、抗疲勞、治療骨質疏松、預防老年癡呆等多種保健功能。紅曲色素穩(wěn)定性好，安全性高，并不斷有新的功效被發(fā)現，值得深入研究[3-4]。

藥用植物內生真菌普遍存在于健康植物組織和器官中，種類繁多，分布廣泛，是一個巨大的菌種資源寶庫[5]。雖然許多種藥用植物的化學成分及藥效功能已明確，但是其共生的微生物類群及其和微生物的生理互作還有待闡明[6]。植物 懷 地 黃（Rehmannia glutinosa）為玄參科（Scrphulariaceae）地黃屬（Rehmannia）多年生草本植物，有清熱涼血，養(yǎng)陰生津的功效[7]。近幾年的研究表明，懷地黃內生菌及其代謝產物具有抑菌、促生等活性作用[8-9]。

紅曲霉（Monascus）為子囊菌門（Ascomycecota）散囊菌目（Eurotiales）的絲狀真菌。至今，紅曲霉屬及其屬內物種的分類地位在國際上都沒有被統(tǒng)一。血紅紅曲霉（Monascus sanguineus）于1995年被分離于伊拉克的阿拉伯河（Shatt-al-Arab River）[10]，還曾在印度尤納塔克邦（Karnataka）的石榴（Punica granatum）中被分離得到[11]。盡管在我國紅曲霉應用歷史悠久，但菌種來源相對單一，大多分離自紅曲米、釀酒大曲、發(fā)酵糟、紅腐乳、丟糟、酒醅等材料中[12-15]。菌種的分類地位大都為紅色紅曲霉進化枝（SectionRubri），包括紅色紅曲霉（M.ruber）和紫色紅曲霉（M.purpureus）[16]。本研究從藥用植物懷地黃中首次分離得到能夠產生豐富可溶性紅色素的內生真菌M.sanguineus，為我國紅曲霉屬菌種拓展了新的來源，通過2個M.sanguineus培養(yǎng)菌株的形態(tài)學觀察和基因序列分析相結合的手段對菌株RJL03進行了詳細的描述和鑒定，初步探討了菌種M.sanguineus與M.purpureus的關系，為懷地黃及紅曲霉屬真菌的進一步研究和開發(fā)應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源

藥用植物懷地黃于2016年10月采自河南省焦作市武陟縣北郭鄉(xiāng)東安村地黃人工種植基地（海拔97 m，35.01°N，113.20°E），取回后立即進行內生真菌分離（圖1）。菌株M.sanguineus（SICC 3.292）購自四川省工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（Sichuan Center of Industrial Culture Collection,SICC）。

圖1 藥用植物材料懷地黃Fig.1 Plant material Rehmannia glutinosa

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養(yǎng)基（貨號：P8931）、麥芽浸粉瓊脂（malt extract agar,MEA）培養(yǎng)基（貨號：LA4980），購自北京索萊寶科技有限公司；查氏酵母膏瓊脂（Czapek yeast extract agar,CYA）培養(yǎng)基（貨號：M4208B），購自山東拓普生物工程有限公司。

1.1.3 主要試劑和儀器

2.5%戊二醛固定液（貨號：P1126），購自北京索萊寶科技有限公司；1×磷酸鹽緩沖液（貨號：SH30256.01），購自美國HyClone公司；Taq酶（貨號：DTM-101），購自日本東洋紡公司；HWS型智能恒溫恒濕箱，購自寧波東南儀器有限公司；BME生物顯微鏡，購自上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司；JSM-5600LV低真空掃描電子顯微鏡，購自日本電子光學公司。

1.2 內生真菌的分離培養(yǎng)

取新鮮的懷地黃塊根先在自來水下沖洗干凈，并在無菌條件下，依次用70%乙醇表面殺菌1 min，無菌水沖洗3次，0.1%氯化汞溶液浸泡3 min，最后用無菌水清洗5次，晾干。再將其切成0.5 cm×1 cm×0.5 cm的小塊，然后接種于含有1%雙抗溶液（mycillin，100 IU/L）的PDA培養(yǎng)基上，于28℃環(huán)境下培養(yǎng)3～5 d，待懷地黃塊周圍長出真菌后，轉移到新鮮PDA培養(yǎng)基上，直至得到菌落單一的純化菌株[17]。將分離得到的菌株RJL03用于后續(xù)試驗。

1.3 真菌的形態(tài)學鑒定

將菌株RJL03和SICC 3.292分別接種于PDA、MEA、CYA培養(yǎng)基上，置于25℃環(huán)境下培養(yǎng)7 d。其間記錄其生長速率并詳細描述其菌落特征。光學顯微鏡觀察采用透明膠帶法制片，在載玻片上滴1滴乳酸酚棉藍染液，用透明膠帶將菌絲粘上。在菌絲面滴1滴乙醇，放在有染液的玻片上，再在膠帶上表面滴1滴染液，覆上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察菌絲、孢子、孢子梗、孢子囊等的顯微特征。掃描電鏡觀察采用插片培養(yǎng)法培養(yǎng)菌株，待菌絲爬片后輕輕取出蓋玻片進行處理。附有菌的玻片放入2.5%的戊二醛固定液中固定4 h以上，然后用1×磷酸鹽緩沖液漂洗3次。采用不同質量分數梯度（50%、70%、80%、90%、95%、100%）的乙醇依次浸泡脫水20 min，最后轉入純的乙酸異戊酯中置換1 h，噴金后進行菌株形態(tài)觀察[18]。

1.4 真菌基因組提取及序列擴增

使用真菌基因組提取試劑盒提取菌株RJL03和SICC 3.292 的 DNA，使 用 通 用 引 物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3′）對rDNA的ITS片段進行擴增，進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR），反應條件為：94℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，50.3 ℃退火30 s，68 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。使用通用引物NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）/NS8（ 5′-TCCG CAGGTTCACCTACGG-3′）對rDNA的18S片段進行擴增。PCR反應條件為：94℃預變性4 min；94℃變性45 s，50.3 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min 45 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR擴增采用20 μL反應體系，包括預混Taq酶 10 μL，ddH2O 6.6 μL，DNA 1.8 μL，上下游引物各 0.8 μL[19]。PCR 產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并純化后送至天津金唯智生物科技有限公司進行雙向測序。

1.5 真菌的系統(tǒng)發(fā)育學分析

對雙向測序得到的基因序列拼接并檢查，將測序結果提交到GenBank。使用菌株RJL03的ITS和18S rDNA序列作為查詢序列，在NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進行BLAST比對，下載與查詢序列相似的序列，得到15條18S rDNA序列，17條ITS rDNA序列，所得序列用于后續(xù)的系統(tǒng)發(fā)育分析。采用MAFFT網頁服務器（https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/）對同源序列進行多序列比對，使用MEGA 7.0軟件手動調整序列[20]。核苷酸替換模型使用MrModeltest 2.3進行選擇，采用raxmlGUI 1.5軟件[21]按照最大似然法（maximum likelihood,ML）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中自展數（bootstrap）為1 000，模型為GTR+I。

2 結果和分析

2.1 產紅色素真菌的形態(tài)學鑒定

RJL03培養(yǎng)7 d后，CYA培養(yǎng)基上菌落直徑為24～26 mm，PDA上為28～31 mm，MEA上為29～32 mm（圖2A～C）。菌株在CYA培養(yǎng)基上生長受限，而在PDA與MEA上生長速率相當。在不同培養(yǎng)基上，菌落初均為白色，后產色素變紅，絨氈狀，可溶性紅色素在MEA培養(yǎng)基中存在最為明顯。菌絲分枝，分隔；分生孢子倒梨形，單生或至多10個成短鏈狀，大小為（8.0～16.5）μm×（7.5～14.0）μm；孢子囊球形，外殼褐色，直徑32～70 μm；孢子梗菌絲狀，子囊孢子橢圓形，子囊孢子橢圓形，大小為（6.0～7.5）μm×（4.0～5.0）μm，表面平滑，無色或紅色（圖2D～G）。菌株SICC 3.292（非模式菌株）與RJL03宏觀形態(tài)略有不同，其產色素量較RJL03略低，而微觀形態(tài)基本一致。通過與《真菌鑒定手冊》等資料[22-25]比對，可以確定菌株RJL03為紅曲霉屬（Monascus）物種。然而，僅依據形態(tài)學特征很難準確地將物種鑒定到種一級水平，尤其是紅曲霉屬的物種分類還未被統(tǒng)一，這更加給RJL03物種的確定增加了難度。因此，我們進一步采用序列分析的分子學手段來獲得更多的分類信息。

2.2 真菌的ITS和18S序列分析

測序后得到菌株RJL03和SICC 3.292的18S序列長度分別為1655和1680bp。整理后提交GenBank，獲得ITS序列號為MF175372和MF372833。如圖3所示，根據18S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，RJL03與SICC 3.292菌株處于同一分支，親緣關系最近，相似度達93%。而且可以看出，物種M.sanguineus進化枝與M.purpureus進化枝親緣關系較近，相似度達91%。18S rDNA序列在進化上比較保守，同屬菌株的18S rDNA序列堿基差異較小，在系統(tǒng)發(fā)育研究中可以鑒定到屬及以上。而且GenBank中除本研究得到的2條M.sanguineus的18S序列外，無可用比對序列，故進一步對ITS rDNA序列進行分析。ITS區(qū)進化較快，在真菌的種間存在著豐富的變異，而在種內不同菌株間卻高度保守，可以用它鑒定到種及以下水平。

測序得到RJL03和SICC 3.292菌株的ITS序列長度分別為589和584 bp（序列號分別為MF175371和MF372832）。如圖4所示，根據ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，5個M.sanguineus菌株處于同一分支，親緣關系達100%。另外，物種M.sanguineus與M.purpureus進化枝親緣關系較近，相似度達92%。M.sanguineus、M.purpureus和M.ruber與其他4個紅曲霉屬物種親緣關系較遠。結合形態(tài)學結果及根據2個基因序列的分析結果，可將RJL03鑒定為血紅紅曲霉（Monascus sanguineus），并且菌株SICC 3.292也被確定為物種M.sanguineus。

圖2 內生真菌RJL03的形態(tài)特征Fig.2 Morphology of endophytic fungi RJL03

3 討論

本研究根據形態(tài)觀測和序列分析的結果將RJL03鑒定為M.sanguineus。但值得提出的是，BARBOSA等[16]在2017年采用多相方法對紅曲霉屬的研究中，根據多基因序列分析暫時提出將M.sanguineus與M.purpureus視為同一物種，在圖3和圖4中的M.sanguineus、M.purpureus和M.ruber被視為紅色紅曲霉組合（SectionRubri），保留其下2個物種M.purpureus和M.ruber，另外的如M.floridanus等7個物種被視為佛羅里達紅曲霉組合（SectionFloridani）。其中佛羅里達紅曲霉組合中的7個物種親緣關系都較遠，把它們分別視為獨立物種無疑，但是廣泛存在于我國的紅色紅曲霉組合中的物種來源復雜，其內物種多樣性問題值得深入研究[10-11,26]。本研究中在同條件下培養(yǎng)對比SICC 3.292與RJL03發(fā)現其培養(yǎng)特征仍有差異。與BARBOSA等[16]的M.purpureus對比存在較大差別，故本研究傾向于大多數學者的觀點，仍視M.sanguineus為獨立物種[23，25，27-29]。

圖3 基于18S rDNA序列的RJL03與SICC 3.292進化樹Fig.3 Maximum likelihood tree based on RJL03 and SICC 3.292 18S rDNAgene sequences

圖4 基于ITS rDNA序列的RJL03與SICC 3.292進化樹Fig.4 Maximum likelihood tree based on RJL03 and SICC 3.292 ITS rDNAgene sequences

目前關于M.sanguineus所產紅色素的應用研究還不是很多，有如RASHMI等采用響應面法對其液態(tài)發(fā)酵產色素條件進行優(yōu)化，紅色素產量可達55.67 CVU/mL[11]，并對其作為天然紅色素潛在來源進 行 了 探 索[30]。 稻 屬 植 物（Oryzaspp.）是M.sanguineus好的固態(tài)發(fā)酵底物，該紅色素有革蘭氏陽性細菌的抑菌活性，可產生霉桔素（citrinin）[31]。另外，筆者也對該菌作為天然紅色素的來源進行了探索，發(fā)現其固態(tài)培養(yǎng)菌絲中紅色素提取液最大吸收波長在515 nm處[17]，而液態(tài)發(fā)酵液中水溶性色素成分不單一，最大吸收波長在474 nm處[32]，色素產量較高，存在進一步進行固態(tài)發(fā)酵或液態(tài)發(fā)酵研究其產紅色素最佳條件的價值。

本研究從購自河南焦作人工種植的懷地黃中初步分離得到了13株植物內生真菌，這些真菌包括青霉屬（Penicilliumsp.）、曲霉屬（Aspergillussp.）、木霉屬（Trichodermasp.）等，并且首次從懷地黃中分離鑒定得到了Monascus sanguineus描述種，拓寬了紅曲霉屬菌種資源的來源。初步探討了M.sanguineus與M.purpureus的關系，認為M.sanguineus應為獨立物種，以期為紅曲霉屬菌種資源的分類鑒定及開發(fā)利用提供理論依據。

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