牛曉靜　魯靜　段曉穎　徐立然

摘要：目的 建立淫羊藿中黃酮類成分HPLC指紋圖譜。方法 采用Agilent ZORBAX Eclispse SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m），以乙腈（A）-水（B）為流動相，梯度洗脫（0～8 min，15%→25%A；8～25 min，25%A；25～32 min，25%→33%A，32～48 min，33%→38%A；48～60 min，38%→60%A；60～70 min，60%→85%A；70～75 min，15%A），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為270 nm，進樣量10 ?L。對11批淫羊藿指紋圖譜進行相似度分析及方法學考察。結果 11批淫羊藿藥材有21個共有峰，相似度為0.845～0.952，對5個色譜峰進行了歸屬；方法學考察結果表明，建立的分析方法重復性、精密度、穩(wěn)定性良好；相似度分析將11批淫羊藿分為4大類，與淫羊藿物種鑒定結果一致。結論 不同產地淫羊藿有一定的相似性，HPLC指紋圖譜能夠為淫羊藿的物種鑒定及內在質量評價提供依據。

關鍵詞：淫羊藿；黃酮類成分；指紋圖譜；高效液相色譜法

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2019）03-0088-05

Abstract： Objective To establish HPLC fingerprints of flavonoids ingredients in Epimedii Folium. Methods The chromatographic fingerprint was obtained with Agilent ZORBAX Eclispse SB-C18 （4.6 mm × 150 mm， 5 ?m） as chromatographic column， with acetonitrile （A） - water （B） as the mobile phase for gradient elution （0–8 min， 15%→25% A； 8–25 min， 25% A； 25–32 min， 25%→33% A； 32–48 min， 33%→38% A； 48–60 min， 38%→60% A； 60–70 min， 60%→85% A； 70～75 min， 15% A）. The flow rate was 1.0 mL/min， and the column temperature was maintained at 30 ℃. The detection wavelength was set at 270 nm. The similarity analysis and methodological investigation were conducted to fingerprints of 11 batches of Epimedii Folium. Results There were 21 common peaks with similarities between 0.845 and 0.952 in 11 batches of Epimedii Folium and 5 chromatographic peaks were identified. The methodological investigation results showed that the established analytical method had good repeatability， precision and stability. Similarity analysis divided 11 batches of Epimedii Folium into 4 categories， consistent with the identification results of Epimedii Folium species. Conclusion Epimedii Folium from different producing areas have a certain of similarities. HPLC fingerprints can provide basis for species identification and intrinsic quality evaluation of Epimedii Folium.

Keywords： Epimedii Folium； flavonoids ingredient； fingerprints； HPLC

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim.或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥葉，夏、秋季蓮葉茂盛時采收，曬干或陰干[1]。產地多集中在中國東北、西北、華東、西南及山西、河南等[2]，由于不同品種在形態(tài)特征、生境特征、居群大小、繁殖方式、資源利用狀況和地方土名等方面的差異，物種鑒定尚存在諸多疑問[3-4]。指紋圖譜是基于對中藥物質群整體作用的認識，借助波譜和色譜等技術獲得中藥化學成分的光譜或色譜圖，是實現鑒別中藥真實性、評價質量一致性和產品穩(wěn)定性的可行模式，具有信息量大、特征性強、整體性和模糊性等特點，能對中藥內在質量進行有效表征、綜合評價和全面控制[5]。本課題組采用指紋圖譜方法對淫羊藿黃酮類成分進行分析，并對5種黃酮類成分進行歸屬，為淫羊藿的物種歸屬和鑒定提供一定依據。

1 儀器與試藥

Waters e2695型高效液相色譜儀（美國沃特世公司），Waters 2998型紫外檢測器（美國沃特世公司），TU-1800PC型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），CP225D型電子天平（德國賽多利斯集團），BSA224S-CW型電子天平（德國賽多利斯集團）。

11批淫羊藿編號為S1～S11，依次為箭葉淫羊藿（20140217-1，東北吉林）、淫羊藿（130716，甘肅隴南）、柔毛淫羊藿（20140303，四川）、箭葉淫羊藿（20140303-2，甘肅）、淫羊藿（130107，甘肅陽縣）、箭葉淫羊藿（20140303-1，甘肅）、朝鮮淫羊藿（20140217-2，東北吉林）、淫羊藿（20140303，陜西）、箭葉淫羊藿（140301，甘肅隴南）、朝鮮淫羊藿（131107，遼寧遼陽）、朝鮮淫羊藿（131015，吉林通化），經本院陳天朝主任藥師鑒定，符合2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）規(guī)定。淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ對照品（批號分別為110737-200415、111852- 201102），中國食品藥品檢定研究院；朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C（批號分別為130520、130518、130601），成都普菲德生物技術有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，水為高純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Agilent ZORBAX Eclispse SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m），以乙腈（A）-水（B）為流動相，梯度洗脫（0～8 min，15%→25%A；8～25 min，25%A；25～32 min，25%→33%A；32～48 min，33%→38%A；48～60 min，38%→60%A；60～70 min，60%→85%A；70～75 min，15%A），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長270 nm，進樣量10 ?L。理論板數按淫羊藿苷峰計算應均不低于5000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ對照品，精密稱定，加甲醇溶解稀釋，制成混合對照品溶液，濃度分別為朝藿定A 48.84 ?g/mL、朝藿定B 95.2 ?g/mL、朝藿定C 0.1031 mg/mL、淫羊藿苷52.5 ?g/mL、寶藿苷Ⅰ6.475 ?g/mL。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末（過3號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）1 h，再稱定質量，用稀乙醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。進樣前用0.45 ?m微孔濾膜過濾。

2.3 指紋圖譜方法學考察

2.3.1 精密度試驗

取淫羊藿樣品（批號130716），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，連續(xù)測定6次，記錄色譜圖。以參照峰的保留時間和峰面積為參比，結果供試品溶液中各共有峰相對保留時間的RSD為0.04%～0.971%，相對峰面積的RSD為0.15%～2.97%，表明該方法精密度好。

2.3.2 重復性試驗

取淫羊藿樣品（批號130716），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。結果供試品溶液中各共有峰相對保留時間的RSD為0.13%～1.48%，相對峰面積的RSD為0.56%～3.20%，表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗

取淫羊藿樣品（批號130716），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。結果24 h內供試品溶液中各共有峰相對保留時間的RSD為0.19%～3.38%，相對峰面積的RSD為0.526%～2.65%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.3.4 專屬性試驗

精密吸取空白溶液10 ?L，注入色譜儀，按規(guī)定的梯度條件洗脫，結果表明陰性對照無干擾。

2.4 樣品測定

取11批淫羊藿樣品（見表1），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，結果見圖1。

2.5 特征指紋圖譜的建立

2.5.1 參照峰的選擇

在各批樣品指紋圖譜中，淫羊藿苷的保留時間居中，分離度良好，且為淫羊藿的主要黃酮類成分之一，故確定13號峰淫羊藿苷為參照峰（S）。

2.5.2 特征指紋圖譜的建立及相似度評價

將11批淫羊藿色譜圖數據導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A）》進行自動匹配，以淫羊藿共有模式圖譜為標準，進行整體相似度評價，11批淫羊藿的相似度為0.845～0.952，同時確定了21個共有峰，根據對照品保留時間與紫外光譜圖指認了其中10、11、12、13、20號峰分別為朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶藿苷Ⅰ，共有模式見圖2，混合對照品HPLC圖見圖3。11批淫羊藿指紋圖譜共有峰相對保留時間和相對峰面積見表1、表2，相似度評價結果見表3。

對各批淫羊藿指紋圖譜進行直觀分析可見，保留時間52 min之前的色譜峰有良好的相似度；保留時間在52～75 min之間的極性相對較小的成分各批次之間有較大差異，其中，S1～S9號各色譜圖比較相似，與S10、S11號色譜圖有較大差異。根據相似度評價可以看出，不同產地、批次的淫羊藿有一定的相似性，但也存在一定的差異，各共有峰峰面積差異較大，黃酮類成分含量有較大差異。S2、S5、S8相似度在0.990～0.995，S7、S10、S11相似度在0.990～0.995，S1、S4、S6、S9相似度在0.952～0.971。這3類相似度較高的樣品分別為淫羊霍、朝鮮淫羊藿、箭葉淫羊藿，與淫羊藿物種鑒定結果一致，而S3與其他批次有差異，為柔毛淫羊藿。

3 討論

指紋圖譜在中藥質量的綜合評價和控制方面有很大的發(fā)展，在化學指紋圖譜、生物指紋圖譜和代謝指紋圖譜等技術方面都有突破性的進展。除用于考察中藥材的歸屬、鑒別[6-10]，以提供生產前原料藥材真?zhèn)蝺?yōu)劣的鑒別依據，更可用于中藥生產過程的質量控制，追蹤制劑中某些化學成分的變化，監(jiān)測原料藥材與成品之間、成品各批次間質量的一致性及穩(wěn)定性[11-14]。

淫羊藿因物種來源不同，質量有差異，某些產地樣品相似度不好，這給進一步對淫羊藿進行藥效學研究帶來極大不便。本研究建立了淫羊藿中黃酮類成分的指紋圖譜方法，并對其中5個成分進行指認，方法簡便快捷、精密度、重復性良好，結果表明能夠客觀反映各共有峰所代表的化學成分含量高低，11批樣品相似度為0.845～0.952。不同產地、批次的淫羊藿有一定的相似性，但也存在一定的差異，指紋圖譜能夠為淫羊藿的物種鑒定及內在質量評價提供依據，更能反映出淫羊藿各有效成分含量的綜合差異。

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（收稿日期：2018-02-27）

（修回日期：2018-05-23；編輯：陳靜）