張斌　王曉薇　徐春江　丁慎華　朱薇珊　錢雪梅

摘要：目的 觀察健脾解毒方對(duì)過表達(dá)乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）的肝癌細(xì)胞增殖及PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響。方法 構(gòu)建過表達(dá)HBx肝癌的HepG2細(xì)胞，給予不同濃度健脾解毒方藥物血清進(jìn)行干預(yù)，實(shí)驗(yàn)分為肝癌細(xì)胞空白組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-HBx組和健脾解毒方低、中、高劑量組。采用MTT法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖及凋亡水平，采用Western blot檢測(cè)肝癌細(xì)胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)。結(jié)果 成功構(gòu)建過表達(dá)HBx的肝癌HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖及上調(diào)p-PI3K及p-AKT表達(dá)的作用。健脾解毒方藥物血清干預(yù)后，可不同程度抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，以及下調(diào)p-AKT、p-PI3K表達(dá)的作用，而健脾解毒方低劑量組對(duì)p-PI3K表達(dá)作用不顯著。結(jié)論 健脾解毒方有抑制肝癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡的作用，其機(jī)制與下調(diào)PI3K/AKT通路相關(guān)因子表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：肝癌細(xì)胞；PI3K/AKT信號(hào)通路；乙型肝炎病毒X蛋白；健脾解毒方

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2019）03-0056-04

Abstract： Objective To study the effects of Jianpi Jiedu Prescription on proliferation of HBx overexpression hepatoma cells and expression of PI3K/AKT signaling pathway-related factors. Methods HepG2 cells of HBx overexpression were established. Different concentrations of Jianpi Jiedu Prescription serum were given for intervention. The study was divided into hepatoma cells blank group， pcDNA3.1 group， pcDNA3.1-HBx group and Jianpi Jiedu Prescription low-， medium- and high-dosage groups. Cell proliferation and apoptosis were detected by MTT assay and flow cytometry. The expressions of p-PI3K and p-AKT protein were detected by Western blot. Results HepG2 cells of HBx overexpression were successfully constructed. It was found that HBx overexpression could promote the proliferation of hepatoma cells and up-regulate the expressions of p-PI3K and p-AKT. After intervention with serum of Jianpi Jiedu Prescription， it was found that each Jianpi Jiedu Prescription group inhibited the proliferation of hepatoma cells， promoted apoptosis of hepatoma cells and decreased the expressions of p-AKT and p-PI3K， but Jianpi Jiedu Prescription low-dosage group had no significant effect on p-PI3K. Conclusion Jianpi Jiedu Prescription has the effect of inhibiting the proliferation and promoting apoptosis of hepatoma cells， and its mechanism is related to down-regulating the expression of PI3K/AKT pathway-related factors.

Keywords： hepatoma cells； PI3K/AKT signaling pathway； HBx； Jianpi Jiedu Prescription

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）是發(fā)病率較高的惡性腫瘤，其全球發(fā)病率和死亡率分別居所有腫瘤的第7位和第4位[1]，治療難度極大，預(yù)后很差。目前PLC機(jī)制尚不清楚，因而加強(qiáng)其發(fā)病機(jī)制研究，并尋找有效治療手段是肝癌防治的關(guān)鍵所在[2-3]。PI3K/AKT信號(hào)通路在肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、遷移和存活中扮演重要角色，與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染是肝細(xì)胞癌發(fā)病的獨(dú)立高危因素，其中乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）是一種重要的反式作用因子，能廣泛激活多種原癌基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，是肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要原因，被認(rèn)為在肝癌發(fā)生過程中發(fā)揮直接促癌作用[6-8]。我們前期通過二甲基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝癌模型，采用健脾解毒方對(duì)其干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)有延緩肝癌發(fā)病的作用，其機(jī)制與中藥下調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)有關(guān)[9-10]。為進(jìn)一步探索其機(jī)制，本研究構(gòu)建過表達(dá)HBx的肝癌HepG2細(xì)胞，采用健脾解毒方藥物血清進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)過表達(dá)HBx的肝癌細(xì)胞增殖及PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株

肝癌HepG2細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。采用RPMI1640進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)（培養(yǎng)液含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素及10%胎牛血清），其中培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37 ℃、5%CO2，每隔3～4 d進(jìn)行傳代，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 動(dòng)物

雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量（100±10）g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SXCK（滬）2015-0008。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3 藥物

健脾解毒方（黃芪38 g，豬苓15 g，八月札18 g，麩炒白術(shù)24 g，仙鶴草18 g，石見穿18 g，薏苡仁12 g，野葡萄藤18 g）10劑，飲片由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院藥劑科提供，常規(guī)水煎濃縮成1000 mL，含原藥材1.5 g/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 主要試劑與儀器

胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA、RPMI 1640培養(yǎng)液及小牛血清，Thermo Fisher Scientific公司；DMSO、MTT和Trizol RNA試劑，Sigma公司；鼠抗人SEPP1單克隆抗體及兔抗人GAPDH單克隆抗體，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。96孔培養(yǎng)板，Nunc公司；電子天平，MettlerToledo公司；CO2培養(yǎng)箱，Binder公司；CK40型多功能倒置相差顯微鏡，Olympus公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 中藥藥物血清制備

大鼠隨機(jī)分為健脾解毒方藥物血清組和對(duì)照組。健脾解毒方藥物血清組大鼠給予50 g/kg健脾解毒方灌胃（按成人體質(zhì)量用藥劑量換算），對(duì)照組大鼠灌服等體積生理鹽水，連續(xù)5 d。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，末次給藥后2 h。腹主動(dòng)脈采血，離心，分離血清，56 ℃滅活，使用0.22 μm微孔過濾除菌，分裝，置于-80 ℃冰箱保存。

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

用限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoRI對(duì)Plvx-ires-zsgreen1表達(dá)載體和目的片段分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物采用DNA凝膠回收試劑盒回收，取4 μL回收后的目的片段與2 μL載體，用1 μL T4 DNA連接酶于16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)菌，接種于含氨芐的LB平板上培養(yǎng)，37 ℃過夜培養(yǎng)，次日挑單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并小量提取質(zhì)粒，對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI單酶切鑒定，同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將鑒定結(jié)果正確質(zhì)粒和陽性菌送到上海華大基因生物公司進(jìn)行測(cè)序。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存于液氮中的HepG2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行傳代，每2～3 d換液1次，長(zhǎng)滿后常規(guī)胰蛋白酶消化法傳代培養(yǎng)。48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為肝癌細(xì)胞空白組、pcDNA3.1組（將空質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)）、pcDNA3.1-HBx組（將HBx轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)）和中藥低劑量組（在pcDNA3.1- HBx轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后加入體積分?jǐn)?shù)為10%健脾解毒方藥物血清）、中劑量組（在pcDNA3.1-HBx轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后加入體積分?jǐn)?shù)為15%健脾解毒方藥物血清）、高劑量組（在pcDNA3.1-HBx轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后加入體積分?jǐn)?shù)為20%健脾解毒方藥物血清）。

2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞濃度為1×104，每孔約200 μL。培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，重新加入溫育液，于培養(yǎng)24 h及48 h每孔加入20 μL MTT液（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h后棄上清，加入DMSO，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度（OD）。抑制率（%）=（1-用藥組平均OD值÷對(duì)照組平均OD值）×100%。

2.5 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

收集培養(yǎng)肝癌細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，棄上清液，PBS進(jìn)行清洗2次，將緩沖液、AnnexinⅤ-FITC 抗體及PI染液依次加入，室溫避光放置15 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 Western blot檢測(cè)p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)

以RIPR裂解液收獲細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液并測(cè)定蛋白濃度；蛋白上樣量為20 μg，SDS PAGE膠濃度為8%，蛋白轉(zhuǎn)移至0.45 μm PVDF膜上，孵一抗（p-PI3K、p-AKT、GAPDH抗體均為1∶1000）4 ℃過夜，TBST洗滌3次，孵二抗1∶2000，室溫2 h；TBST洗滌6次；ECL發(fā)光試劑盒暗室發(fā)光、顯影、定影。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，采用Image J圖像軟件計(jì)算灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 真核表達(dá)載體 pcDNA3.1（+）-HBx構(gòu)建及鑒定

將pcDNA3.1（+）酶切片段與HBx片段連接，陽性克隆通過XhoI和XbaI進(jìn)行雙酶切，用于連接和轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑單克隆進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶XhoI對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示有235 bp的HBx條帶和4128 bp的載體條帶，與預(yù)期片段大小相符，經(jīng)測(cè)序進(jìn)一步證明插入基因正確，獲得pcDNA3.1（+）-HBx載體，表明HBx表達(dá)載體構(gòu)建成功。見圖1、圖2。

4.2 健脾解毒方對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

與肝癌細(xì)胞空白組比較，pcDNA 3.1-HBx組肝癌細(xì)胞抑制率顯著降低（P<0.01）；與pcDNA 3.1-HBx組比較，中藥各劑量組肝癌細(xì)胞抑制率顯著升高（P<0.01）。見表1。

4.3 健脾解毒方對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響

與肝癌細(xì)胞空白組比較，pcDNA 3.1-HBx組肝癌細(xì)胞凋亡率無明顯差異；與pcDNA 3.1-HBx組比較，中藥各劑量組肝癌細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.01），中藥高劑量組升高最明顯。見表2。

4.4 健脾解毒方對(duì)癌細(xì)胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)的影響

與肝癌細(xì)胞空白組比較，pcDNA 3.1-HBx組肝癌細(xì)胞p-PI3K及p-AKT蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01）；與pcDNA 3.1-HBx組比較，中藥中、高劑量組p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01）。見表3、圖3。

5 討論

HBV慢性感染是肝癌發(fā)病的獨(dú)立高危因素。整合的HBV-DNA 基因組編碼的HBx是一種重要的反式作用因子，能廣泛激活多種原癌基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，是肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要原因，被認(rèn)為在肝癌發(fā)生過程中發(fā)揮直接促癌作用[6]。HBx蛋白可干擾癌細(xì)胞間的黏附連接，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮間葉表型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移。HBx在肝癌發(fā)病中與多種信號(hào)通路的參與密切相關(guān)，其中Wang等[7]將HBx基因轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，其機(jī)制與激活PI3K/AKT信號(hào)通路的表達(dá)有關(guān)。Liu等[8]采用轉(zhuǎn)染HBx基因的肝癌細(xì)胞接種裸鼠后發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，其機(jī)制與PI3K/AKT信號(hào)通路的激活有關(guān)。本研究成功構(gòu)建了過表達(dá)HBx的真核表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞后，也發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖作用，表明HBx與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

PI3K是一種脂類激酶，活化的PI3K可將磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3可使其主要下游底物AKT準(zhǔn)確定位到近膜區(qū)并發(fā)生構(gòu)象變化，同時(shí)活化的AKT轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，作用于下游底物，調(diào)控細(xì)胞代謝、蛋白合成、細(xì)胞增殖與凋亡等重要生理過程，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及分化調(diào)節(jié)。PI3K/AKT信號(hào)通路是一條廣泛存在于細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞增殖調(diào)控中起重要作用，其表達(dá)異常存在于多種癌細(xì)胞中，尤其與肝癌發(fā)病關(guān)系密切。本研究對(duì)過表達(dá)HBx的肝癌細(xì)胞進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖作用與上調(diào)p-PI3K及p-AKT的表達(dá)有關(guān)。

肝癌屬中醫(yī)學(xué)“臌脹”“肝積”“積聚”等范疇。多由飲食不節(jié)（潔）、情志不遂、勞倦等多種因素引起邪毒內(nèi)生而引起，病機(jī)特點(diǎn)是本虛標(biāo)實(shí)，本虛以脾氣虛為主，標(biāo)實(shí)為邪毒（熱、濕熱毒邪）郁肝，治以益氣健脾、理氣解毒。健脾解毒方為上海中醫(yī)藥大學(xué)范忠澤教授經(jīng)驗(yàn)方，對(duì)多種惡性腫瘤有抑制作用，該方由黃芪、白術(shù)、豬苓、枳殼、八月札、石見穿及野葡萄藤等組成，具有健脾益氣、化濕解毒功效。既往研究發(fā)現(xiàn)該方具有提高免疫、改善臟器功能及抗多種消化道腫瘤等功效，尤其對(duì)肝癌有較好的療效[11-12]。我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，該方可較好延緩二乙基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝癌的發(fā)生和發(fā)展，其機(jī)制部分與調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路的表達(dá)有關(guān)[9-10]。本研究采用健脾解毒方對(duì)過表達(dá)HBx的肝癌HepG2細(xì)胞開展研究，發(fā)現(xiàn)中藥各劑量組有抑制肝癌細(xì)胞增殖作用，其機(jī)制與下調(diào)p-AKT蛋白表達(dá)有關(guān)（P<0.01），進(jìn)一步通過對(duì)p-PI3K表達(dá)情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)除低劑量組作用不顯著外，中藥中、高劑量組均顯著下調(diào)p-PI3K的表達(dá)（P<0.01），表明健脾解毒方抑制肝癌細(xì)胞作用可能與下調(diào)p-AKT及p-PI3K蛋白表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2018-09-17）

（修回日期：2018-10-17；編輯：華強(qiáng)）