易亞喬　劉檢　劉林　成紹武　廖君　王國佐　譚琥　劉吉勇　陳俊煒　王瑋　郭艷幸　葛金文

摘要：目的 觀察加味腦泰方對大鼠缺氧/復(fù)氧損傷海馬神經(jīng)元炎性通路SIRT1/NF-κB的影響，初步探討其作用機(jī)制。方法 原代分離、培養(yǎng)及鑒定SD大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元，采用缺氧24 h、復(fù)氧2 h干預(yù)構(gòu)建缺氧/復(fù)氧細(xì)胞模型。將培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為正常組、空白血清對照組、模型組、陽性藥藥物血清組和加味腦泰方藥物血清組，待缺氧24 h后，除正常組和模型組給予等量培養(yǎng)液外，其余各組分別給予相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)10%藥物血清或空白血清，繼續(xù)復(fù)氧共孵育培養(yǎng)2 h；采用MTT法檢測海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力，高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)檢測海馬神經(jīng)元沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1（SIRT1）、核因子-κB抑制蛋白（IκBα）、核因子-κB（NF-κB）蛋白表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力顯著降低（P<0.01），神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)及樹突、樹突棘斷裂或減少，細(xì)胞明顯受損，且神經(jīng)元內(nèi)SIRT1、IκBα蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），NF-κB蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.05）；與模型組比較，陽性藥藥物血清組和加味腦泰方藥物血清組海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力明顯增加（P<0.05），神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、樹突棘受損明顯改善，且神經(jīng)元內(nèi)SIRT1、IκBα蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05），NF-κB蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）。結(jié)論 加味腦泰方對缺氧/復(fù)氧損傷海馬神經(jīng)元內(nèi)炎性相關(guān)信號通路SIRT1/ NF-κB具有明顯的調(diào)控作用，這可能是其保護(hù)缺氧/復(fù)氧損傷海馬神經(jīng)元繼而抗血管性癡呆的重要機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：加味腦泰方；海馬神經(jīng)元；缺氧/復(fù)氧；沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1；核因子-κB抑制蛋白；核因子-κB；血管性癡呆；大鼠

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2019）03-0045-06

Effects of Modified Naotai Prescription on Inflammatory Pathway of SIRT1/NF-κB in Hypoxia/Reoxygenation Injured Hippocampal Neuron

YI Yaqiao1， LIU Jian2， LIU Lin2， CHENG Shaowu1， LIAO Jun3， WANG Guozuo1， TAN Hu1，

LIU Jiyong1， CHEN Junwei1， WANG Wei1， GUO Yanxing4， GE Jinwen3

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；

2. First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China；

3. Integrative Medicine Basic Key Disciplines of Hunan Province， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 4. Luoyang Bonesetting Hospital of Henan Province， Luoyang 471002， China

Abstract： Objective To observe the effects of modified Naotai Prescription on inflammatory pathway of SIRT1/NF-κB in hypoxia/reoxygenation injured hippocampal neurons； To explore the mechanism of action. Methods Hippocampal neurons from SD rats were primitively isolated， cultured and identified. Hypoxia/ reoxygenation （H/R） cell model was established by hypoxia 24 h and reoxygenation 2 h intervention. The cultured cells were randomly divided into normal group， blank serum group， model group， positive medicine serum group and modified Naotai Prescription group. Normal group and model group were given same amount culture medium， while other groups were given relevant amount of 10% medicated serum or blank serum to continue for reoxygenation and incubate for 2 h. Hippocampal neuronal cell viability was detected by MTT assay. The expressions of SIRT1， IκBα and NF-κB in hippocampal neurons were detected by HCA. Results Compared with the normal group， hippocampal neuronal cell viability significantly decreased （P<0.01）， the neural network and dendrites and dendritic spines were broken or reduced， the cells were obviously damaged， and the expressions of SIRT1 and IκBα protein in neurons significantly decreased （P<0.05）， and the expression of NF-κB protein significantly increased （P<0.05） in the model group. Compared with the model group， hippocampal neuronal cell viability significantly increased （P<0.05）， the neural network and dendritic spine were significantly improved， and the expressions of SIRT1 and IκBα protein in the neurons increased （P<0.05）， and the expression of NF-κB protein was down-regulated （P<0.05） in positive medicine serum group and modified Naotai Prescription group. Conclusion Modified Naotai Prescription has a significant regulatory effect on the inflammatory-related signaling pathway SIRT1/NF-κB in hippocampal neurons after hypoxia/reoxygenation injury， which may be an important mechanism for protecting hypoxic/reoxygenated hippocampal neurons and then anti-vascular dementia.

Keywords： modified Naotai Prescription； hippocampal neurons； hypoxia/reoxygenation； SIRT1； IκBα； NF-κB； vascular dementia； rats

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是由于缺血性、出血性卒中或造成記憶、認(rèn)知和行為等腦區(qū)低灌注的腦血管疾病所致的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征[1]。VD發(fā)病率逐年增加，不但嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，同時也帶來沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，目前臨床尚無治療VD的特效藥物，主要從改善腦微循環(huán)、認(rèn)知功能障礙、神經(jīng)遞質(zhì)紊亂及保護(hù)腦細(xì)胞等方面著手[2-3]。VD發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，研究發(fā)現(xiàn)沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1（silent information regulator 1，SIRT1）是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點，在調(diào)控血管性認(rèn)知功能障礙及細(xì)胞衰老、凋亡等方面均發(fā)揮著重要作用[4]，另外，SIRT1 mRNA在海馬神經(jīng)元中高度表達(dá)，其能通過抗炎效應(yīng)減輕缺血性腦損傷，而炎癥反應(yīng)在VD等慢性腦缺血繼發(fā)性神經(jīng)損傷中起主要作用。因此，SIRT1可能是抗VD的潛在靶點。

加味腦泰方源自《醫(yī)林改錯》補(bǔ)陽還五湯，并結(jié)合臨床治療VD用藥經(jīng)驗加減而成，由黃芪、當(dāng)歸、川芎、地龍、石菖蒲、三七、遠(yuǎn)志組成。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，加味腦泰方能明顯改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并抑制炎癥相關(guān)因子核因子-κB（NF-κB）的表達(dá)[5-6]。本研究采用原代海馬神經(jīng)元缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）體外細(xì)胞模擬缺血再灌注VD模型，觀察加味腦泰方對H/R損傷海馬神經(jīng)元保護(hù)作用，并從SIRT1炎性通路初步探討其機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 動物

SD雌性大鼠5只，SPF級，受孕18 d；SD雄性大鼠9只，SPF級，體質(zhì)量180～220 g，均購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2013-0004。飼養(yǎng)于溫度（25±1）℃、相對濕度（55±5）%環(huán)境，12 h光照，自由攝食飲水。

1.2 藥物

加味腦泰方（黃芪、川芎、地龍、當(dāng)歸、石菖蒲、三七、遠(yuǎn)志），飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，水煎制成浸膏粉（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制劑教研室提?。?；奧拉西坦注射液，廣東世信藥業(yè)有限公司，批號1610002。本實驗中加味腦泰方和奧拉西坦給藥劑量分別為12 g/kg和0.36 g/kg。

1.3 主要試劑與儀器

Neurobasal medium、B27 Supplement（Gibco公司），DMEM/F12、FBS（Hyclone公司），兔抗大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）多克隆抗體（武漢博士德生物工程科技公司），兔抗大鼠SIRT1、IκBα、NF-κB多克隆抗體（Proteintech公司），小鼠抗大鼠β-tublin和β-actin抗體、FITC標(biāo)記羊抗兔IgG、R-PE標(biāo)記羊抗小鼠IgG及DAPI（Abcam公司）。SW-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司），S8PAO型體視顯微鏡（德國Leica公司）、CO48R-230型細(xì)胞培養(yǎng)箱（New Brunswick Galaxy公司），OPERETTA型高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)（HCA，美國PerkinElmer公司）。

2 實驗方法

2.1 藥物血清制備

取SD雄性大鼠9只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白血清對照組、陽性藥藥物血清組、受試藥藥物血清組，分別給予等量蒸餾水、臨床等效劑量奧拉西坦和加味腦泰方浸膏粉灌胃，每日2次，連續(xù)3 d，末次給藥1 h，10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血，3000 r/min離心15 min，收集血清，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾后，分裝至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)與鑒定

取孕18 d SD大鼠，10%水合氯醛麻醉后迅速取全腦置于體視顯微鏡下，分離海馬，加入等體積胰蛋白酶和膠原酶，37 ℃消化15 min，終止消化，收集上清液，1000 r/min離心5 min，棄上清液，重懸，200目篩網(wǎng)過篩，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個/mL，接種至預(yù)先左旋多聚賴氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)板中，4～6 h后全量換成無血清培養(yǎng)基（98%Neurobasal、1%B27、1% L-谷氨酰胺），之后每3 d半量換液1次。待神經(jīng)元生長至5～7 d，棄掉孔內(nèi)液體，冷0.01 mol/L PBS潤洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.25%Triton-100作用15 min，5%BSA封閉30 min，加入兔抗大鼠NSE和小鼠抗大鼠β-tublin一抗稀釋液（體積比1∶100），4 ℃濕盒避光孵育過夜。次日棄液，冷0.01 mol/L PBS潤洗5次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔和RP-E標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗稀釋液（體積比1∶200），37 ℃避光孵育30 min，棄液，冷0.01 mol/L PBS潤洗5次，加入DAPI稀釋液，室溫避光孵育20 min，棄液，冷0.01 mol/L PBS潤洗3次，最后每孔加入50 μL PBS，于HCA上觀察并拍照。

2.3 造模、分組及給藥

取生長7 d成熟海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為正常組、空白血清對照組、模型組、陽性藥藥物血清組、加味腦泰方藥物血清組，參照文獻(xiàn)[7]方法，建立H/R細(xì)胞模型。將細(xì)胞培養(yǎng)液換成無糖DMEM培養(yǎng)基，同時置入三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱中，持續(xù)通入混合氣體（95%N2+5%CO2），流速保持在0.5 L/min，缺氧24 h后，模型組重新?lián)Q成無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，其余組全量換液相應(yīng)含10%空白血清、奧拉西坦藥物血清及加味腦泰方藥物血清的無血清培養(yǎng)基，再將各組放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中持續(xù)復(fù)氧2 h。正常組則用無血清培養(yǎng)基正常培養(yǎng)26 h，不做任何處理。

2.4 MTT法檢測海馬神經(jīng)元活力

將海馬神經(jīng)元接種至96孔板中，待細(xì)胞生長至5～7 d，隨機(jī)分為正常組、空白血清對照組、模型組、陽性藥藥物血清組和加味腦泰方藥物血清組，除正常組外，其余各組分別進(jìn)行缺氧24 h、復(fù)氧2 h處理，每組設(shè)3個復(fù)孔，造模后，每孔加入20 μL MTT，37 ℃孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，于水平搖床上震搖15 min，于酶標(biāo)儀492 nm波長處測定吸光度（OD），并計算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力（%）=實驗組OD值÷正常組OD值×100%。

2.5 HCA檢測沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1、核因子-κB抑制蛋白、核因子-κB蛋白表達(dá)

將海馬神經(jīng)元接種至96孔板中，待細(xì)胞生長至5～7 d，隨機(jī)分為正常組、空白血清對照組、模型組、陽性藥藥物血清組和加味腦泰方藥物血清組，上述各組細(xì)胞進(jìn)行缺氧24 h、復(fù)氧2 h后，棄掉孔內(nèi)液體，冷0.01 mol/L PBS潤洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.25%Triton-100作用15 min，5%BSA封閉30 min后，加入小鼠抗大鼠β-actin和兔抗大鼠SIRT1、IκBα或NF-κB一抗稀釋液（體積比1∶100），4 ℃避光孵育過夜，棄液，冷0.01 mol/L PBS潤洗5次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔和RP-E標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗稀釋液（體積比1∶200），37 ℃避光孵育30 min，棄液，冷0.01 mol/L PBS潤洗5次，加入DAPI稀釋液，室溫避光孵育20 min，棄液，冷0.01 mol/L PBS潤洗3次，最后每孔加入50 μL PBS，于HCA上進(jìn)行熒光檢測并拍照，隨機(jī)選取6個視野，先找到DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核，再找到β-actin標(biāo)記的細(xì)胞骨架，計算DAPI與β-actin融合區(qū)域（即目標(biāo)細(xì)胞）陽性表達(dá)蛋白的熒光強(qiáng)度值，最后通過分析得到每個細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度值（即相對熒光強(qiáng)度值）。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間差異采用方差分析，方差齊用LSD檢驗，方差不齊用Dunnett's T3檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)特點及免疫熒光鑒定

在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，海馬神經(jīng)元之間可見突觸連接，胞體明顯、突起縱橫交錯，并相互交織成豐富的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色及HCA檢測，NSE標(biāo)記陽性者呈綠色熒光，在神經(jīng)元骨架被β-tublin標(biāo)記后，可見綠色熒光在胞漿中均呈陽性表達(dá)，提示所得細(xì)胞為目標(biāo)細(xì)胞（即海馬神經(jīng)元）。結(jié)果見圖1。

4.2 加味腦泰方對海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響

與正常組比較，模型組海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力均明顯降低，提示造模成功；與模型組比較，陽性藥藥物血清組和加味腦泰方藥物血清組細(xì)胞活力顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見圖2。

4.3 加味腦泰方對缺氧/復(fù)氧損傷海馬神經(jīng)元沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1、核因子-κB抑制蛋白、核因子-κB蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)HCA檢測，藍(lán)色熒光為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核，橙黃色熒光為RP-E標(biāo)記的細(xì)胞骨架β-actin，綠色熒光為FITC標(biāo)記的炎性相關(guān)陽性表達(dá)蛋白SIRT1、NF-κB或IκBα，HCA隨機(jī)選取6個視野，先找到DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核（即總細(xì)胞數(shù)），再找到β-actin標(biāo)記的細(xì)胞骨架（即表達(dá)區(qū)域），計算DAPI與β-actin融合區(qū)域內(nèi)FITC標(biāo)記的陽性表達(dá)蛋白（即蛋白相對表達(dá)量），進(jìn)而分析得到每個細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度值（即相對熒光強(qiáng)度值）。經(jīng)H/R干預(yù)造模后，HCA檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組及空白血清對照組海馬神經(jīng)元SIRT1、IκBα蛋白平均熒光強(qiáng)度值明顯降低，NF-κB蛋白平均熒光強(qiáng)度值明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)及樹突、樹突棘斷裂或減少，細(xì)胞明顯受損；與模型組比較，陽性藥藥物血清組和加味腦泰方藥物血清組海馬神經(jīng)元SIRT1、IκBα蛋白平均熒光強(qiáng)度值明顯增加，NF-κB蛋白平均熒光強(qiáng)度值明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、樹突棘受損情況得到明顯恢復(fù)，而熒光強(qiáng)度與蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示加味腦泰方對H/R損傷海馬神經(jīng)元內(nèi)炎性相關(guān)蛋白SIRT1、NF-κB和IκBα具有明顯的調(diào)控作用，其可能是保護(hù)H/R損傷海馬神經(jīng)元的重要機(jī)制之一。見圖3～圖8。

5 討論

VD是以認(rèn)知、記憶等諸多功能缺損為主，并且可能伴有語言、人格或情感障礙的一種獲得性智能持續(xù)性損害疾病，而腦血管病變導(dǎo)致局部或全腦缺血、缺氧，繼而引起腦部與認(rèn)知、記憶等相關(guān)的特定神經(jīng)組織損害是VD發(fā)病的主要病理過程，因而慢性腦缺血成為研究VD發(fā)病機(jī)理的重要組成部分。相關(guān)動物實驗研究表明，雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎術(shù)（2-VO法）能持續(xù)造成慢性腦低灌注狀態(tài)，從而使腦組織特別是易損區(qū)域（如海馬、皮層等）產(chǎn)生缺血缺氧性損傷，導(dǎo)致漸進(jìn)性VD發(fā)生[8]。本研究采用原代海馬神經(jīng)元H/R體外細(xì)胞模型，結(jié)果顯示H/R干預(yù)造模后海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率顯著降低，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)及樹突、樹突棘斷裂或減少，細(xì)胞明顯受損，很好模擬了體內(nèi)VD發(fā)病腦缺血供氧不足的海馬神經(jīng)元損傷過程，提示造模成功。

長壽蛋白（silent mating type information regulation 2 homolog，Sirtuin）是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的一種去乙酰化酶，與酵母沉默調(diào)控因子2（silent information regulator 2，Sir2）蛋白同源，由SIRT1～7組成，其中SIRT1與Sir2同源性最高。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1介導(dǎo)的信號通路與學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知功能的改善密切相關(guān)，SIRT1 mRNA在海馬神經(jīng)元具有豐富的表達(dá)，敲除小鼠SIRT1后，突觸可塑性明顯受損，學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知能力下降[9]。此外，SIRT1/NF-κB信號通路介導(dǎo)了VD病理機(jī)制的炎癥過程，慢性缺血缺氧VD發(fā)生時，NF-κB作為腦缺血后反應(yīng)最早的炎癥因子，SIRT1可促使其下游因子NF-κB亞單位RelA/p65去乙?；?，進(jìn)而抑制其轉(zhuǎn)錄活性，同時抑制IκBα磷酸化，減少炎癥因子和趨化因子的產(chǎn)生，防止炎癥引起的神經(jīng)元損傷[10-11]。本實驗結(jié)果表明，與正常組比較，經(jīng)H/R干預(yù)造模后，海馬神經(jīng)元內(nèi)SIRT1、IκBα蛋白水平顯著降低，NF-κB蛋白水平顯著增加，且細(xì)胞明顯受損，而給予加味腦泰方藥物血清干預(yù)后，SIRT1、NF-κB和IκBα蛋白表達(dá)異常被明顯逆轉(zhuǎn)，這提示加味腦泰方可能是通過調(diào)控SIRT1/NF-κB信號通路進(jìn)而保護(hù)H/R損傷海馬神經(jīng)元。

VD好發(fā)于中風(fēng)之后，屬中醫(yī)學(xué)“呆證”“善忘”等范疇[12]，病機(jī)特點為本虛標(biāo)實，病位在腦，五臟氣血虧虛為本，痰瘀阻絡(luò)為標(biāo)，虛、瘀、痰是其重要的病因病機(jī)。加味腦泰方以黃芪為君，當(dāng)歸為臣，川芎、地龍等為佐藥，具有益氣活血、化痰祛瘀之功效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸小分子多糖、三七皂苷R1等具有顯著抗炎、抗氧化、改善腦缺血和促進(jìn)VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能[13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，腦泰方通過抗血小板活化、抗血栓、抗炎等作用對缺血缺氧腦組織起到明顯的保護(hù)作用[14-15]。本實驗結(jié)果亦再次佐證了其調(diào)控炎性通路進(jìn)而保護(hù)H/R損傷海馬神經(jīng)元的作用，而腦缺血缺氧是VD的重要病因之一，因此，我們推測加味腦泰方可能對VD有防治作用。

綜上，加味腦泰方對H/R損傷海馬神經(jīng)元炎性通路SIRT1/NF-κB具有明顯的調(diào)控作用，這可能是其保護(hù)H/R損傷海馬神經(jīng)元繼而抗VD的重要機(jī)制之一，后續(xù)實驗我們將從基因水平，并輔以基因沉默技術(shù)，進(jìn)一步闡明加味腦泰方對H/R損傷海馬神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制。

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（收稿日期：2018-06-20）

（修回日期：2018-07-20；編輯：華強(qiáng)）