蘇杉 王蓉 趙敏 吳晨 高慧琴
摘要:目的 觀察秦艽不同配伍藥對對風寒濕痹型類風濕關節(jié)炎(RA)模型大鼠白細胞介素-6(IL-6)及血管內皮生長因子(VEGF)的影響,從中藥藥性及復方配伍理論的角度揭示中藥藥性-病證-功效的關聯(lián)性。方法 80只SD大鼠隨機分為空白對照組、Ⅱ型膠原組、病證模型組、陽性對照組、單味秦艽組、秦威組(秦艽配伍威靈仙)、秦桑組(秦艽配伍桑寄生)、秦防組(秦艽配伍防己),每組10只。注射Ⅱ型膠原乳劑并施加風寒濕刺激制備風寒濕型RA大鼠模型。造模完成后各給藥組給予相應藥液,空白對照組、Ⅱ型膠原組及病證模型組給予生理鹽水。實驗過程中,記錄大鼠一般狀況;每3 d測量1次大鼠左后足跖厚度,并計算足跖腫脹度;實驗第38日大鼠進行關節(jié)炎指數(shù)(AI)評分;ELISA檢測大鼠血清IL-6含量;Western blot和RT-PCR分別檢測大鼠踝關節(jié)VEGF的蛋白和mRNA表達。結果 與空白組比較,Ⅱ型膠原組和病證模型組足跖腫脹度、AI評分、血清IL-6含量、踝關節(jié)VEGF蛋白和mRNA表達明顯增加(P<0.01);與病證模型組比較,各中藥組足跖腫脹度、AI評分、血清IL-6含量、踝關節(jié)VEGF蛋白和mRNA表達均有所減少,其中秦威組最明顯(P<0.01)。結論 對于風寒濕痹型RA,藥性平溫相配療效優(yōu)于平平相配、平寒相配及單味秦艽,實驗結果與中醫(yī)“療寒以熱藥”的原則基本相符。
關鍵詞:秦艽;風寒濕痹;類風濕關節(jié)炎;白細胞介素-6;血管內皮生長因子;大鼠
中圖分類號:R285.5 文獻標識碼:A 文章編號:1005-5304(2019)03-0039-06
Abstract: Objective To observe the effects of different compatibility of Gentianae Macrophyllae Radix (Qinjiao) on IL-6 and vascular endothelial growth factor (VEGF) in rheumatoid arthritis (RA) model rats with wind-cold-dampness arthralgia. To reveal the correlation between TCM property-syndrome-effect from the perspective of TCM properties and compound compatibility theory. Methods Totally 80 healthy SD rats were randomly divided into blank control group, collage Ⅱ model group, wind-cold-dampness syndrome model group, positive control group, single-taste Qinjiao group, Qinjiao-Weilingxian group (Qinwei group), Qinjiao-Sangjisheng group (Qinsang group), Qinjiao-Fangji Group (Qinfang group), 10 rats in each group. Rat model of wind-cold-dampness type RA was established by injecting type Ⅱ collagen emulsion and applying wind-cold-dampness stimulus. After the establishment of the model, the blank control group, collage Ⅱ model group and wind-cold-dampness syndrome model group were given normal saline, and the corresponding liquid medicine was given to each administration group. In the experiment, the general state of rats was recorded. The thickness of the left posterior metatarsal of rats was measured every 3 days, and the swelling degree of the metatarsal was calculated. The arthritis index (AI) was evaluated on the 38th day of the experiment. The content of IL-6 in serum of rats wasdetected by ELISA. Expression of VEGF in ankle joint of rats was detected by Western blot. Expression of VEGF mRNA in ankle joint was detected by RT-PCR. Results Compared with the blank group, the swelling degree, AI score, serum IL-6 content, VEGF protein expression level and VEGF mRNA expression in collage Ⅱ model group and wind-cold-dampness syndrome model group were significantly increased (P<0.01). Compared with the wind-cold-dampness syndrome model group, the foot swelling degree, AI score, serum IL-6 content, ankle VEGF protein expression level and VEGF mRNA expression of administration group were decreased, and Qinwei group was the most significant (P<0.01). Conclusion For RA of wind-cold-dampness arthralgia type, the treatment efficacy of mild and warm is better than the combined effect of mild and cold TCM or mild TCM drugs. The experimental results are basically consistent with the principle of "treating cold diseases should use hot medicine" in TCM.
Keywords: Gentianae Macrophyllae Radix; wind-cold-dampness arthralgia; rheumatoid arthritis; interleukin-6; vascular endothelial growth factorarthritis; rats
類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關節(jié)病變?yōu)橹饕Y狀的慢性、全身性自身免疫疾病。其臨床主要表現(xiàn)為局部關節(jié)疼痛、腫脹、晨僵、關節(jié)軟骨破壞、貧血等[1],屬中醫(yī)學“痹證”范疇。本研究在中醫(yī)理論指導下,通過前期對秦艽不同寒熱配伍的研究[2-4]及相關文獻[5-8],選溫性祛風濕藥威靈仙、平性祛風濕藥桑寄生、寒性祛風濕藥防己與平性祛風濕藥秦艽組成平溫相配、平平相配、平寒相配的配伍關系,觀察秦艽寒熱不同配伍藥對對風寒濕痹RA模型大鼠血清白細胞介素-6(IL-6)及踝關節(jié)血管內皮生長因子(VEGF)表達的影響,從中藥藥性及復方配伍理論角度揭示中藥藥性-病證-功效的關聯(lián)性。
1 實驗材料
1.1 動物
SPF級SD大鼠80只,雌雄皆用,體質量(200±20)g,甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心提供,動物許可證號SCXK(甘)2015-0002。飼養(yǎng)于溫度24~26 ℃、相對濕度45%~65%環(huán)境,自由攝食飲水。
1.2 藥物及制備
秦艽、威靈仙、桑寄生、防己,飲片購自蘭州惠仁堂大藥房,甘肅中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室李成義教授鑒定均為正品。中藥藥液均由甘肅中醫(yī)藥大學中藥藥劑實驗室協(xié)助制備。單味秦艽組:稱秦艽300 g,第1次加10倍量水煎煮1 h,第2次加8倍量水煎煮30 min,合并2次藥液,濃縮至每毫升含原藥材1.67 g。秦艽配伍組(秦威組、秦桑組、秦防組)按1∶1比例分別取秦艽和威靈仙、秦艽和桑寄生、秦艽和防己各150 g,煎煮方法同上,藥液制備完成后置于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩@坠俣嘬掌h大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司,批號20150501,將雷公藤多苷片碾成粉末狀,加適量生理鹽水,配制為0.4 mg/mL雷公藤多苷混懸液,備用。
1.3 主要試劑與儀器
天然牛Ⅱ型膠原,北京Solarbio公司,批號908E052;完全弗氏佐劑,美國Sigma公司,批號SLBS1330V;冰醋酸,天津市富宇精細化工有限公司,批號20150110;IL-6試劑盒,江蘇菲亞生物科技有限公司,批號MM-0190R1;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒,北京Solarbio公司,批號20170915;GAPDH Polyclonal Antibody,Immunoway Biotechnology公司,批號B5201;Anti-VEGF antibody,美國abcam公司,批號ab46154;HRP,Goat Anti-Rabbit IgG,美國Abbkine公司,批號A21020;SYBR? Green Realtime PCR Master Mix擴增試劑盒,TOYOBO公司,批號717000;ReverTra Ace? qPCR反轉錄試劑盒,TOYOBO公司,批號711000;GAPDH引物,生工生物工程(上海)股份有限公司,批號D829KA6434;VEGF-F,生工生物工程(上海)股份有限公司,批號1408556120;VEGF-R,生工生物工程(上海)股份有限公司,批號1408556127。改裝后智能人工氣候箱(氣候箱中裝3個風扇,控制風速為5 m/s),寧波江南儀器廠,型號RXZ-380A-LED;酶標儀,美國BIO-RAD公司,型號Benchmark Plus;電泳儀,北京六一生物科技有限公司,型號DYCZ-24DN;凝膠成像儀,美國Azure Biosystems公司,型號C300;梯度PCR儀,美國BIO-RAD公司,型號S1000TM Thermal Cycler;實時熒光定量PCR儀,美國ABI公司,型號7500。
2 實驗方法
2.1 分組
大鼠適應性喂養(yǎng)3 d,按隨機數(shù)字表法將80只大鼠分為空白對照組、Ⅱ型膠原組、病證模型組(Ⅱ型膠原+風寒濕刺激)、陽性對照組、單味秦艽組、秦威組、秦桑組、秦防組,共8組,每組10只。
2.2 膠原乳劑制備
精密吸取0.3 mL冰醋酸置于50 mL容量瓶內,加入注射用水定容,得0.1 mol/L冰醋酸溶液。精密稱量天然牛Ⅱ型膠原5 mg置于25 mL容量瓶內,置于冰水浴中,用配制好的冰醋酸溶液稀釋、定容,得Ⅱ型膠原溶液,置于4 ℃冰箱保存過夜。注射當日,取25 mL Ⅱ型膠原溶液與等體積完全弗氏佐劑在冰水浴中充分混勻乳化,得0.1 mg/mL膠原乳劑。
2.3 造模
參考文獻[3]方法,于實驗第1日,除空白組外其余組大鼠在背部兩點(背部脊柱兩側)及尾根部一點,剃毛,皮內注射膠原乳劑0.1 mL,共0.3 mL。第12日大鼠左后足跖皮內注射0.1 mL膠原乳劑進行二次免疫,空白組在相同部位注射等體積注射用水。從初次注射膠原乳劑第2日開始,除空白組及Ⅱ型膠原組外,其余組大鼠均采用改裝后的智能人工氣候箱進行風寒濕痹型RA模型的造模。風寒濕環(huán)境條件:溫度4 ℃,風速5 m/s,相對濕度≥95%,風寒濕刺激時大鼠足跖沒入0 ℃冰水混合液中。每日1次,30 min/次,連續(xù)18 d。
2.4 給藥
造模結束后,各中藥組按25 g/kg給予相應藥液,陽性對照組按6 mg/kg給予雷公藤多苷混懸液,其余組給予等量生理鹽水。每只大鼠給藥3 mL,每日1次,連續(xù)21 d。
2.5 觀察指標及方法
2.5.1 一般狀況觀察
實驗過程中進行大鼠一般狀況觀察。
2.5.2 足跖腫脹度
游標卡尺測量大鼠左后足跖厚度,每3 d測量1次,計算大鼠足跖腫脹度。足跖腫脹度=(致炎后足跖厚度-致炎前足跖厚度)÷致炎前足跖厚度。
2.5.3 關節(jié)炎指數(shù)評分
于實驗第38日起分別對大鼠進行關節(jié)炎指數(shù)(AI)評分,采用5級評分法:正常、無關節(jié)炎癥計0分,足趾關節(jié)輕度發(fā)紅或腫脹計1分,足趾或踝關節(jié)中度腫脹計2分,踝關節(jié)嚴重腫脹或踝關節(jié)以下全部腫脹計3分,整個足爪腫脹或關節(jié)嚴重變形、不能負重計4分。每只大鼠4只足爪評分之和作為最終的AI評分,每只大鼠最高不超過16分。
2.5.4 大鼠血清白細胞介素-6檢測
大鼠末次給藥1 h后,股動脈取血5 mL,靜置2 h,3000 r/min離心15 min,取血清,ELISA試劑盒檢測大鼠血清中IL-6含量,操作嚴格按試劑盒說明書進行。
2.5.5 Western blot檢測血管內皮生長因子的蛋白表達
大鼠踝關節(jié)部位,每組3只,提取踝關節(jié)蛋白樣本,并檢測蛋白濃度,將樣本上樣至12%SDS-PAGE凝膠梳孔中,電泳,轉膜,封閉,一抗VEGF(1∶899)中孵育,過夜后,洗膜,二抗孵育,洗膜,ECL發(fā)光顯影,凝膠成像儀曝光,拍照,應用Image J軟件檢測條帶光密度值,目的條帶光密度值與內參條帶光密度值,得目的蛋白的相對表達量。
2.5.6 RT-PCR檢測血管內皮生長因子mRNA表達
取大鼠踝關節(jié)部位,每組3只,提取踝關節(jié)RNA樣本。按照說明書運用Trizol法提取樣本總RNA,微量紫外分光光度計檢測樣本RNA濃度,確保OD260/280在1.8~2.0之間,再將RNA樣本采用ReverTra Ace? qPCR反轉錄試劑盒進行反轉錄,反應體系為50 μL,具體步驟按說明書進行操作。反應參數(shù)設置為:37 ℃、 15 min,98 ℃、5 min,然后-20 ℃保存。GAPDH為內參,采用SYBR? Green Realtime PCR Master Mix擴增試劑盒,反應體系為20 μL,具體步驟按說明書操作。引物1 μL:VEGF上游5'-TCGGAGAGCAAC GTCACTATG-3',下游5'-TGGTCTGCATTCACATC TGC-3',產物長度40 bp。反應參數(shù):95 ℃、60 s,95℃、15 s,60 ℃、60 s,融解曲線分析,共40個循環(huán)。
3 統(tǒng)計學方法
采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料服從正態(tài)分布時以—x±s表示,多組間數(shù)據(jù)比較用方差分析,兩兩比較用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
4 結果
4.1 一般狀況
實驗過程中,空白組大鼠較活躍,毛發(fā)潔白柔順,二便正常,體質量增加快。造模組大鼠初次免疫后活動減少,毛發(fā)蓬松、色微黃,左后足跖略紅腫,二便正常,體質量增加較緩慢;二次加強免疫后2 h,造模組大鼠活動明顯減少,喜側臥,左后足跖腫脹明顯,行走困難,二便正常;加強免疫后第2日,左后足跖腫脹,皮膚觸之柔軟,呈紫紅色,發(fā)熱明顯;加強免疫后第3日,個別大鼠左后足跖出現(xiàn)蛻皮現(xiàn)象;加強免疫后第4日,個別大鼠出現(xiàn)四肢腫脹;二次免疫過程中,大鼠體質量增加緩慢。治療第2日,足跖腫脹均不同程度減小;治療第6日,大鼠活動增加;治療階段,各給藥組左后足跖顏色由紫紅色變深紅色至淡紅色,多數(shù)最后恢復為膚色,體質量增加稍快,行走較自如。Ⅱ型膠原組及病證模型組未見明顯恢復。
4.2 秦艽不同配伍藥對對大鼠足跖腫脹度的影響
實驗第18日,與空白組比較,造模組大鼠足跖腫脹度明顯升高(P<0.01);實驗第36日,與病證模型組比較,各給藥組大鼠足跖腫脹度均明顯降低(P<0.05,P<0.01),其中秦威組最明顯,且秦威組腫脹度明顯低于秦防組(P<0.05)。結果見表1。
4.3 秦艽不同配伍藥對對大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分的影響
與空白組比較,Ⅱ型膠原組和病證模型組大鼠AI評分顯著升高(P<0.01),且病證模型組AI評分明顯高于Ⅱ型膠原組(P<0.01);與Ⅱ型膠原組及病證模型組比較,各給藥組大鼠AI評分明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01);各中藥給藥組間比較,秦威組大鼠AI評分明顯低于秦防組(P<0.05)。結果見表1。
4.4 秦艽不同配伍藥對對大鼠血清白細胞介素-6含量的影響
與空白組比較,Ⅱ型膠原組及病證模型組大鼠血清IL-6含量明顯升高(P<0.01);與Ⅱ型膠原組比較,陽性對照組、單味秦艽組、秦威組大鼠血清IL-6含量明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01);與病證模型組比較,各給藥組大鼠血清IL-6含量均明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),其中秦威組血清IL-6含量最低。結果見表2。
4.5 秦艽不同配伍藥對對大鼠踝關節(jié)血管內皮生長因子蛋白表達的影響
與空白組比較,Ⅱ型膠原組與病證模型組大鼠VEGF蛋白表達明顯升高(P<0.01),且病證模型組高于Ⅱ型膠原組(P<0.05);與Ⅱ型膠原組比較,陽性對照組、秦威組、秦防組大鼠VEGF蛋白表達均明顯降低(P<0.01);與病證模型組比較,陽性對照組、秦威組、秦桑組和秦防組大鼠VEGF蛋白表達均明顯降低(P<0.01);各給藥組間比較,陽性對照組、秦威組及秦防組大鼠VEGF蛋白表達明顯低于單味秦艽組及秦桑組(P<0.05,P<0.01)。結果見表3、圖1。
4.6 秦艽不同配伍藥對對大鼠踝關節(jié)血管內皮生長因子mRNA表達的影響
與空白組比較,Ⅱ型膠原組與病證模型組大鼠VEGF mRNA表達明顯升高(P<0.01);與Ⅱ型膠原組及病證模型組比較,陽性對照組、單味秦艽組、秦威組、秦桑組大鼠VEGF mRNA表達明顯降低(P<0.05,P<0.01);各給藥組間比較,單味秦艽組大鼠VEGF mRNA表達明顯高于陽性對照組(P<0.01);秦威組大鼠VEGF mRNA表達明顯高于陽性對照組(P<0.01),而低于單味秦艽組(P<0.01);秦桑組大鼠VEGF mRNA表達明顯高于陽性對照組、單味秦艽組及秦威組(P<0.01);秦防組大鼠VEGF mRNA表達明顯高于陽性對照組、單味秦艽組、秦威組及秦桑組(P<0.01)。見表4。
5 討論
RA不僅侵犯關節(jié)滑膜、軟骨、韌帶和肌肉,還可能影響心、肺等臟器功能[9]。IL-6是一種具有多種生物活性的細胞因子,主要由巨噬細胞、樹突細胞、B細胞、T細胞、成骨細胞、腫瘤細胞等分泌產生[10-11],可介導炎癥反應和免疫反應等[12],在許多炎性疾病中表達量高,如RA、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[13-14]。IL-6不僅參與關節(jié)破壞和炎癥發(fā)生,還可參與RA多系統(tǒng)損害,RA患者出現(xiàn)關節(jié)滑膜、軟骨破壞的局部癥狀及貧血、疲勞、低熱等全身癥狀均與IL-6相關,且全身癥狀的周期性和IL-6周期性相關。IL-6及IL-6受體(IL-6R)水平與RA患者的類風濕因子(RF)、紅細胞沉降率、C反應蛋白(CRP)及臨床表現(xiàn)相關[12]。因此抑制IL-6及IL-6R水平能夠改善RA患者的關節(jié)癥狀,控制病情的發(fā)展。IL-6可提高VEGF的水平,促進炎性細胞滲出,提高關節(jié)血管通透性,加重關節(jié)炎癥及血管翳的形成,血管翳具有類似于腫瘤組織侵蝕的作用,可引起關節(jié)軟骨破壞,對RA的發(fā)生及發(fā)展起重要作用[15-16]。VEGF是RA血管新生的重要因子,主要由成纖維細胞及中性粒細胞等分泌[17]。研究顯示,VEGF在RA患者關節(jié)滑膜處高表達,隨著病情發(fā)展,VEGF含量升高,且與RF含量、紅細胞沉降率及CRP等呈正相關,可作為診斷RA患者關節(jié)損害和預后的重要指標[18]。VEGF抑制劑對于血管新生有特異性的抑制作用,可明顯改善RA病情[19]。
本實驗結果顯示,與空白組比較,Ⅱ型膠原組及病證模型組足跖腫脹度、AI評分、IL-6含量、踝關節(jié)VEGF蛋白相對表達量及踝關節(jié)VEGF mRNA相對表達量明顯升高(P<0.01),且病證模型組高于Ⅱ型膠原組,提示Ⅱ型膠原誘導加風寒濕刺激模型比單純Ⅱ型膠原模型病情嚴重,造?;境晒?。經藥物治療后,各給藥組足跖腫脹度、AI評分、IL-6含量、踝關節(jié)VEGF蛋白及mRNA表達均有不同程度降低,其中秦威組及陽性對照組降低最明顯,優(yōu)于單味秦艽組、秦桑組及秦防組。
綜上所述,藥性平溫相配的秦威組改善風寒濕痹RA的效果優(yōu)于平平相配的秦桑組、平寒相配的秦防組及平性單味秦艽組,其機制可能與其降低血清IL-6含量及踝關節(jié)VEGF表達水平,減輕關節(jié)軟骨破壞及血管翳形成有關。提示對于寒性病證,應給予熱性藥物治療會取得更好的治療效果,與中醫(yī)“療寒以熱藥”治療原則相符。
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(收稿日期:2018-06-29)
(修回日期:2018-07-31;編輯:華強)