朱曉瑜，邢建華，許啟太

(海南綠檳榔科技發(fā)展有限公司，海南 定安 571200)

檳榔是棕櫚科檳榔屬植物檳榔(Areca catechu L.)的成熟果實(shí)，檳榔，始載于晉代著名醫(yī)家李當(dāng)之的〈藥錄〉中[1-2]。原產(chǎn)于馬來西亞，在我國栽培已有1500多年歷史[3]。檳榔提取物(Areca extract)是以檳榔果為原料，經(jīng)提取分離制成的植物提取物[4]，該提取物作為中間體或者原料用于藥品、保健品等[5]。歷代醫(yī)家在臨床當(dāng)中不斷總結(jié)，發(fā)現(xiàn)檳榔具有很多不可代替的療效，在歷次出版的《中華人民共和國藥典》均有收錄。2015年版《中國藥典》記載：檳榔(檳榔干燥成熟種子)具有殺蟲、消積、行氣、利水、截瘧的功效；大腹皮(檳榔干燥果皮)具有行氣寬中、行水消腫的功效[6]。現(xiàn)代科學(xué)研究表明檳榔對神經(jīng)系統(tǒng)[7]、內(nèi)分泌系統(tǒng)[8]和消化系統(tǒng)[9]具有保護(hù)作用。目前尚未檢索到檳榔提取物國內(nèi)、外標(biāo)準(zhǔn)，對此，本課題組初步建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，擬為檳榔提取物的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

FA2004型分析電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；BS-6K 型電子天平(上海友聲衡器有限公司)；KQ-100型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司生產(chǎn))；SX-2.5-10 型馬弗爐(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；DHG-9240A烘箱(江蘇江東精密儀器有限公司；Agilent 1260系列高效液相色譜儀(附紫外檢測器)，色譜柱：強(qiáng)陽離子交換鍵合硅膠柱Phenomenex Luna SCX Column，250 mm×4.6 mm，5 μm。

1.2 藥品及試劑

檳榔提取物：海南綠檳榔科技發(fā)展有限公司提供(樣品批號為：20151208、20151209、20151223、20160110、20160113、20160302、20160806、20161022、20170115、20170118)；氫溴酸檳榔堿對照品：中國食品藥品檢定研究院所提供，111684～201401。

檳榔提取物所用檳榔果采集于海南省萬寧市，由河南大學(xué)中藥研究所李昌勤教授鑒定為棕櫚科檳榔屬植物檳榔(Areca catechu L.)的成熟果實(shí)。

水為純凈水，甲醇和乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 感官要求

取本品三批樣品，嗅其氣味和嘗其滋味；另取試樣適量置于白色瓷盤中觀察其色澤、外觀，并檢查有無異物，結(jié)果見表1。

表1 檳榔提取物感官要求

根據(jù)觀察結(jié)果，本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定檳榔提取物的感官要求描述為：本品為淺黃色至棕褐色粉末，色澤均勻；具有檳榔特殊氣味，味微澀；外觀均勻，無肉眼可見雜質(zhì)。

2.2 鑒別實(shí)驗(yàn)

參照中華人民共和國藥典(2015年版)一部檳榔中鑒別項(xiàng)方法，制定檳榔提取物鑒別方法。

取氫溴酸檳榔堿對照品，加甲醇制成每1 mL含1.5 mg的溶液，作為對照品溶液。取檳榔提取物粉末2.5 g，置50 mL容量瓶中，加適量甲醇,超聲(150 W)處理20 min，用甲醇定容，靜置，即得供試品溶液。分別吸取供試品溶液、對照品溶液各5 μL，點(diǎn)于硅膠G板上，展開劑為V(環(huán)己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(濃氨試液)=7.5∶7.5∶0.2，展開約8 cm，取出晾干。置碘蒸氣中熏至斑點(diǎn)清晰，置可見光下檢視。結(jié)果：供試品薄層色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯示相同的褐色斑點(diǎn)。

2.3 檳榔堿含量測定

檳榔堿是檳榔提取物中重要的活性成分之一，參考《中國藥典》2015年版一部檳榔【含量測定】項(xiàng)，采用高效液相色譜法測定。

色譜柱：SCX-強(qiáng)陽離子交換樹脂柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相∶V(乙腈)∶V(0.2%磷酸)= 55∶45(濃氨試液調(diào)節(jié)pH值至3.8)溶液；檢測波長：215 nm；柱溫：室溫；流速：1.0 mL·min-1；理論塔板數(shù)按氫溴酸檳榔堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

對照品溶液制備 取氫溴酸檳榔堿對照品適量，精密稱定，加流動相制成1 mL含0.1 mg的溶液，即得(檳榔堿重量=氫溴酸檳榔堿重量/1.5214)。 供試品溶液制備 取本品約0.25 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加50%乙腈溶液適量，超聲處理30 min，并用50%乙腈溶液定容至刻度，搖勻，過濾。取續(xù)濾液5 mL，置25 mL量瓶中，加50%乙腈溶液定容至刻度，搖勻，即得。

分別吸取供試品溶液、對照品溶液及空白流動相各 10 μL，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果供試品色譜中，在與對照品色譜相同保留時(shí)間有對應(yīng)的峰，空白流動相溶液無干擾。表明系統(tǒng)適應(yīng)性較好。如圖2、圖3、圖4 所示。

圖2 檳榔提取物

圖3 氫溴酸檳榔堿對照品

圖4 空白流動相

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖。

供試品中檳榔堿含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)W計(jì)，數(shù)值以%表示，按公式E.1計(jì)算。

式中：W——檳榔提取物中檳榔堿含量，%；

A1——供試品溶液中檳榔堿的峰面積；

A0——對照品溶液中檳榔堿的峰面積；

C2——供試品溶液中檳榔提取物的濃度(mg·mL-1)；

C0——對照品溶液中檳榔堿的濃度(mg·mL-1)。

本品按干燥品計(jì)算，含檳榔堿(C13H18O7)不得少于6.0%。

精確稱量供試品(批號：20160110)樣品6份，按"3.2.2"項(xiàng)下處理，并按照色譜條件進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計(jì)算檳榔堿的含量和RSD值，RSD為1.48%，表明本實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性好。見表2。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

精密稱量供試品(批號：20160110)樣品，在不同日期、不同分析人員、不同儀器測定6次，每次10 μL，結(jié)果檳榔堿含量的RSD為1.63%，表明儀器精密度良好，可以準(zhǔn)確反映物質(zhì)的量。見表3。

表3 中間精密度試驗(yàn)(n=5)

取供試品(批號：20160302)制成供試液，分別于0、2、4、6、12、24 h，進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，結(jié)果供試品中檳榔堿峰面積的RSD為2.77%(n=6)，表明供試液中檳榔堿在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

稱取已知檳榔堿含量的檳榔提取物樣品(批號：20160302)約0.25 g，共6份，按“3.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別置50 mL量瓶中，加50%乙腈溶液適量，超聲處理30 min，并用50%乙腈溶液定容至刻度，搖勻，過濾。取續(xù)濾液5 mL，置25 mL量瓶中，加50%乙腈溶液定容至刻度，搖勻即得，測定樣品中所含檳榔堿含量。另取50 mL量瓶中續(xù)濾液5 mL，分別置于25 mL量瓶中，分別加入按“3.2.1”項(xiàng)下配置的對照品溶液(含檳榔堿濃度0.13146 mg·mL-1)12.5 mL，50%乙腈溶液定容至刻度，混合均勻即得進(jìn)樣樣品25 mL，按照上述色譜條件進(jìn)樣10 μL，檳榔堿的平均加樣回收率為97.5%，其RSD值為2.6%。見表5。

表5 檳榔堿回收率結(jié)果

2.3.10 線性關(guān)系試驗(yàn)

精密稱取氫溴酸檳榔堿對照品適量，加流動相制成1 mL含5.02 mg氫溴酸檳榔堿的溶液，即得對照品母液。然后稀釋，使對照品溶液理論含氫溴酸檳榔堿濃度分別為0.502,0.251,0.1255,0.06275,0.041833 μg·μL-1(含檳榔堿濃度=含氫溴酸檳榔堿濃度/1.5214)。每次進(jìn)樣10 μL。照含量測定項(xiàng)下的方法測定，以峰面積為橫坐標(biāo)，檳榔堿濃度(μg·μL-1)為縱坐標(biāo)，繪制回歸曲線，計(jì)算線性回歸方程。結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，檳榔堿濃度在0.02750～0.32996 μg·μL-1的范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系。

圖5 氫溴酸檳榔堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.11 樣品測定

取本品按“2.3.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另取氫溴酸檳榔堿對照品按“2.3.1”項(xiàng)下制備對照品溶液，同法測定，按“2.3.5”項(xiàng)下公式計(jì)算，即得。檳榔提取物檳榔堿含量測定結(jié)果見表7。

表7 檳榔提取物檳榔堿含量測定結(jié)果

表7(續(xù))

上述方法學(xué)驗(yàn)證表明，本文建立的高效液相色譜法測定檳榔堿提取物中的檳榔堿的含量，其精密度、線性關(guān)系、準(zhǔn)確度等均符合要求，該方法穩(wěn)定、可靠、可行，可以作為檳榔提取物中檳榔堿的含量測定方法，訂入本標(biāo)準(zhǔn)。

表7可見，10批檳榔提取物中檳榔堿含量按干燥品計(jì)算均不低于6.0%。因此，將本品含檳榔堿按干燥品計(jì)算不少于6.0%訂入本標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

本品符合感官要求；薄層鑒別色譜斑點(diǎn)清晰，分離度好；高效陽離子交換色譜法，流動相為乙腈-0.2%磷酸(濃氨試液調(diào)節(jié)pH值至3.8)溶液(55∶45，v/v);檢測波長215 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL·min-1色譜條件下，檳榔堿的分離度良好，此方法操作簡便，重復(fù)性、精密度、準(zhǔn)確度良好；從線性回歸方程y = 3E + 07x + 102168 ，R2=0.9995可以看出檳榔堿濃度在0.02750～0.32996 μg·μL-1的范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系；檳榔堿按干燥品計(jì)算都大于6.0%，符合要求；所以，本研究建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可以控制檳榔提取物的質(zhì)量。

此次實(shí)驗(yàn)從數(shù)據(jù)分析來看，結(jié)果不錯(cuò)，實(shí)驗(yàn)成功。目前，測定檳榔堿含量的方法主要有滴定法[10]、薄層色譜法[11]、毛細(xì)管電泳法[12]、分光光度法[13]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀[14]、陽離子交換色譜法[15-16]、反相高效液相色譜法[17-22]及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[23-24]等，但滴定法操作繁瑣，準(zhǔn)確度不高，薄層掃描法雖然也可以測量，但是要求高。采用高效陽離子交換色譜法，分離度良好，此方法操作簡便，具有良好的專屬性和準(zhǔn)確度，可有效控制產(chǎn)品質(zhì)量操作簡便，快速，重現(xiàn)性好?？蔀橐院箢愃茖?shí)驗(yàn)提供方法學(xué)借鑒。