郭鵬

(濟(jì)南市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250132)

血管性癡呆(VD)多繼發(fā)于腦動(dòng)脈粥樣硬化等腦血管疾病〔1,2〕，其發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)元凋亡或壞死等病理過程相關(guān)，目前尚無有效治療方法與藥物〔3,4〕。丁基苯酞(NBP)為多靶點(diǎn)腦保護(hù)脂溶性藥物，具有多種藥理作用〔5,6〕，其左旋體及右旋體藥效作用不同，右旋NBP(R-NBP)在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中可拮抗左旋丁基苯酞(L-NBP)；L-NBP有較強(qiáng)抗腦缺血損傷及抗VD作用，但其作用機(jī)制目前尚未完全闡明〔7〕。有研究結(jié)果表明，線粒體氧化應(yīng)激與腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡壞死密切相關(guān)，神經(jīng)細(xì)胞缺血缺氧時(shí)激活活性氧(ROS)及一氧化氮(NO)，誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑，在VD發(fā)生發(fā)展過程中具有中間橋梁作用〔8〕。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)與神經(jīng)細(xì)胞突觸可塑性及神經(jīng)膠質(zhì)增生、記憶沉積形成等密切相關(guān)，在營養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞、參與認(rèn)知功能方面有重要作用〔9〕。本研究通過觀察L-NBP對(duì)VD大鼠海馬組織GDNF表達(dá)的影響，探討L-NBP抗VD的相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇健康雄性6月齡SD大鼠〔體重(220±20)g〕，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號(hào)：SYXK-2013-0025)。隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，L-NBP組，每組20只。

1.1.2試驗(yàn)藥物與試劑 L-NBP(純度99%)，購于石藥集團(tuán)，使用前采用植物油稀釋10倍配制溶劑；超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)，購于南京建成生物工程研究所；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色試劑盒、兔抗GDNF抗體，購于武漢博士德生物工程有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗，美國CST公司提供；Morris水迷宮(DMS-2)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物模型制備 經(jīng)Morris水迷宮篩選學(xué)習(xí)記憶力正常80只大鼠，隨機(jī)選取60只按照參考文獻(xiàn)〔10〕方法采用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈建立大鼠VD模型。造模6 w后應(yīng)用Morris水迷宮篩選造模成功大鼠40只〔(各時(shí)段成績平均逃避潛伏期-對(duì)照組逃避時(shí)間均值)/該組大鼠平均逃避潛伏期≥20%〕，隨機(jī)分為模型組，L-NBP組(10 mg/kg)，每組20只。L-NBP組灌胃給藥10 mg/(kg·d)，連續(xù)給藥3 w，假手術(shù)、模型組給予等體積消毒豆油。

1.2.2大鼠行為學(xué)測(cè)試 主要采用定位航行及空間探索實(shí)驗(yàn)。水溫(20±2)℃，水深30 cm，定位航行實(shí)驗(yàn)：大鼠連續(xù)訓(xùn)練5 d，記錄從入水到爬上平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期；空間探索實(shí)驗(yàn)：記錄2 min內(nèi)大鼠在水池內(nèi)的游泳路徑及穿過平臺(tái)位置次數(shù)。

1.2.3HE染色觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)變化 大鼠采用 4%多聚甲醛固定，斷頭取腦，取視交叉后4 mm與小腦前部位，置于多聚甲醛中浸泡，石蠟切片包埋，蘇木素-伊紅(HE)染色，封片后光鏡下觀察。

1.2.4海馬線粒體SOD、ROS測(cè)定 處死大鼠后取腦，分離海馬組織，按照試劑盒說明書加入線粒體分離試劑A(1 ml/100 mg)制備勻漿，1 000 r/min 4℃離心5 min，取上清液4℃ 3 500 r/min離心10 min，取沉淀即為線粒體。部分加入儲(chǔ)存液重懸線粒體，測(cè)定相應(yīng)指標(biāo)；采用Western印跡方法，取線粒體重懸液，按照試劑盒說明書測(cè)定SOD、ROS水平，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光強(qiáng)度。

1.2.5免疫組化法測(cè)定海馬GDNF表達(dá) 剝離大腦皮層與海馬區(qū)，組織石蠟切片，脫蠟，免疫組化法測(cè)定GDNF蛋白表達(dá)(抗體1∶1 500稀釋)，DAB顯色，復(fù)染后封片，Image-pro plus圖像分析系統(tǒng)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件，計(jì)量資料行單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 大鼠逃避潛伏期模型組>L-NBP組>假手術(shù)組(表1)，穿越平臺(tái)次數(shù)假手術(shù)組>L-NBP組>模型組(P<0.05，表2)。

2.2各組腦組織病理形態(tài)學(xué) 假手術(shù)組細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，數(shù)目較多，核仁明顯；模型組細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)不完整，數(shù)目較少，結(jié)構(gòu)不正常，細(xì)胞核固縮，有增生膠質(zhì)細(xì)胞；與模型組比較，L-NBP組神經(jīng)元及細(xì)胞變性壞死減輕，見圖1。

表1 三組逃避潛伏期比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05，與模型組比較：2)P<0.05；下表同

表2 三組穿越平臺(tái)次數(shù)比較次)

圖1 各組海馬組織CA1區(qū)病理形態(tài)學(xué)(HE染色，×20)

2.3各組海馬線粒體SOD、ROS水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組海馬組織線粒體ROS含量明顯升高，SOD活性明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，L-NBP組線粒體ROS含量明顯降低，SOD活性明顯升高(P<0.05)。見表3。

2.4免疫組化法測(cè)定海馬GDNF表達(dá)水平 免疫組化結(jié)果陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，模型組陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于假手術(shù)組，L-NBP組陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于模型組(P<0.05)，見表3，圖2。

表3 三組海馬線粒體SOD、ROS水平及GDNF蛋白陽性表達(dá)比較

圖2 免疫組化法測(cè)定海馬GDNF蛋白表達(dá)(×400)

3 討 論

有研究結(jié)果顯示NBP可促進(jìn)VD大鼠腦組織海馬區(qū)BDNF mRNA及其蛋白表達(dá)，內(nèi)源性腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)神經(jīng)保護(hù)作用可顯著改善缺血腦組織損傷，但BDNF不易透過血腦屏障，NBP多靶點(diǎn)作用途徑提高了內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用〔11，12〕。治療急性缺血性腦卒中，L-NBP作用強(qiáng)于R-NBP，R-NBP拮抗L-NBP的抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用〔13，14〕。本研究結(jié)果提示應(yīng)用L-NBP后VD大鼠腦組織神經(jīng)功能損傷減輕，學(xué)習(xí)記憶能力改善，L-NBP對(duì)VD大鼠有一定神經(jīng)保護(hù)作用。

有研究顯示，GDNF與學(xué)習(xí)記憶過程相關(guān)，GDNF與其受體酪氨酸激酶(Trk)B結(jié)合后，磷脂酶迅速水化暴露結(jié)合受體部位，再經(jīng)磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)活化，信息向下傳遞，結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)作用，信息整合傳入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)；在線粒體促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)作用下，信息整合存儲(chǔ)，結(jié)合鈣離子發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)GDNF分化轉(zhuǎn)導(dǎo)，GDNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中介信號(hào)為酪氨酸酶磷酸化TrkB，參與學(xué)習(xí)記憶過程〔15～17〕。本研究結(jié)果也提示L-NBP對(duì)VD大鼠有一定神經(jīng)保護(hù)作用，可能通過GDNF介導(dǎo)的PI3K/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)途徑，促進(jìn)損傷神經(jīng)元再生修復(fù)。

神經(jīng)細(xì)胞缺血缺氧時(shí)激活ROS及NO，誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑，在AD發(fā)生發(fā)展過程中，線粒體結(jié)構(gòu)功能異常、氧化應(yīng)激損傷、產(chǎn)生自由基增加均具有中間橋梁作用；腦組織受氧化代謝率高、抗氧化劑水平較低等因素影響，易受ROS介導(dǎo)損傷。線粒體為機(jī)體產(chǎn)生自由基的源泉，可能為ROS損傷的最早靶點(diǎn)，沉默信息調(diào)節(jié)因子(Sirt)3與線粒體能量代謝密切相關(guān)，可通過活化下游靶點(diǎn)SOD、過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α發(fā)揮線粒體保護(hù)作用〔8〕。本研究結(jié)果提示L-NBP可能通過調(diào)節(jié)SOD水平，增強(qiáng)清除ROS能力，調(diào)控線粒體氧化應(yīng)激水平，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，其具體作用途徑尚有待深入探討。