張霞 薛文郁 薛雁明

(忻州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 忻州 034000)

生長(zhǎng)激素釋放肽屬于生長(zhǎng)激素促泌劑的小分子內(nèi)源配體，能夠參與葡萄糖代謝和胰島素的分泌，與胰島素抵抗密切相關(guān)〔1～4〕。研究表明，1型糖尿病患者經(jīng)過胰島素治療后，生長(zhǎng)激素釋放肽水平下降29%，在2型糖尿病患者的后代中發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)激素釋放肽水平下降，而生長(zhǎng)激素釋放肽水平下降能夠在一定程度上抑制胰島素抵抗，是機(jī)體的一種保護(hù)性機(jī)制〔5，6〕。研究報(bào)道稱，生長(zhǎng)激素釋放肽能夠抑制β細(xì)胞減少導(dǎo)致的糖尿病，并且能夠抑制阿霉素等誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔7〕。蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路參與胰島β細(xì)胞凋亡過程，Akt磷酸化水平升高后，Akt信號(hào)通路激活〔8〕。本研究主要探討生長(zhǎng)激素釋放肽對(duì)高糖環(huán)境下的胰島β細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 NIT-1胰島β細(xì)胞由山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院生理實(shí)驗(yàn)室保存，青霉素、鏈霉素、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco；Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Sigma；二喹啉甲酸(BCA)定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；Akt單克隆抗體、磷酸化(p)-Akt單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz；生長(zhǎng)激素釋放肽購(gòu)自上海譜振生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 NIT-1胰島β細(xì)胞用含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，37℃，95%的空氣、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔3～5 d用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。細(xì)胞分為正常組、高糖組、實(shí)驗(yàn)組，其中正常組用正常細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，高糖組和實(shí)驗(yàn)組用含有33.3 mmol/L葡萄糖的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)開始前用10-7mmol/L的生長(zhǎng)激素釋放肽預(yù)處理20 h。

1.3噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖 NIT-1細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，胰蛋白酶消化，以每孔加入3 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，按1.2中方法處理細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，在每個(gè)孔中加入20 μl的MTT溶液，放在37℃反應(yīng)4 h。吸除上清，加150 μl的二甲基亞砜，觀察結(jié)晶物融化后，檢測(cè)490 nm處的光密度值(OD值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 正常組、高糖組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞按照1.2中方法處理后，培養(yǎng)48 h，收集1×106個(gè)細(xì)胞，用冰預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)重懸細(xì)胞2次，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入5 μl碘化丙啶(PI)和5 μl膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)，放在避光環(huán)境中孵育20 min后，再加入400 μl結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.5Western印跡檢測(cè)Akt、p-Akt表達(dá)水平 正常組、高糖組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞按照1.2中方法處理后，培養(yǎng)48 h，按照6孔板每孔中加入100 μl裂解液將細(xì)胞裂解后，4℃，14 000 r/min離心15 min后，蛋白存在于上清溶液中，吸取蛋白上清，用BCA定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。用12%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行電泳。蛋白樣品在上樣前與上樣緩沖液混合煮沸5 min，按照每個(gè)上樣孔加入40 μl變性蛋白樣品，在濃縮膠中用80 V電壓電泳，在分離膠中用120 V電壓電泳。100 V轉(zhuǎn)膜60 min。用5%牛血清白蛋白在室溫中封閉90 min，4℃與1∶1 000倍稀釋的一抗孵育過夜，室溫環(huán)境中與1∶2 000倍稀釋的二抗孵育90 min。顯色顯影后，以Akt為內(nèi)參，分析p-Akt/Akt水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.6Akt信號(hào)通路抑制劑對(duì)細(xì)胞增殖凋亡的影響 20 μg/ml的Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002作用于實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞記為實(shí)驗(yàn)組+抑制劑，48 h后，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western印跡檢測(cè)Akt、p-Akt的表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1生長(zhǎng)激素釋放肽對(duì)細(xì)胞增殖影響 正常組、高糖組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞OD值依次為(1.39±0.05)、(0.68±0.03)、(1.13±0.06)。高糖組OD值明顯低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=21.090，P=0.000)。實(shí)驗(yàn)組OD值明顯高于高糖組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.619，P=0.000)。

2.2生長(zhǎng)激素釋放肽對(duì)細(xì)胞凋亡影響 正常組、高糖組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率依次為：(5.25±0.09)%、(16.34±1.03)%、(10.11±0.58)%。高糖組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.578，P=0.000)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯低于高糖組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.129，P=0.001)。見圖1。

2.3生長(zhǎng)激素釋放肽對(duì)Akt、p-Akt表達(dá)影響 正常組、高糖組、實(shí)驗(yàn)組p-Akt/Akt依次為(0.86±0.05)、(0.24±0.02)、(0.57±0.09)。高糖組p-Akt/Akt明顯低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.941，P=0.000)。實(shí)驗(yàn)組p-Akt/Akt明顯高于高糖組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.200，P=0.003)。見圖2。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

圖2 各組Akt、p-Akt蛋白表達(dá)

2.4Akt信號(hào)通路抑制劑對(duì)細(xì)胞增殖影響 實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)組+抑制劑p-Akt/Akt依次為(0.62±0.06)、(0.13±0.02)，OD值依次為(1.23±0.09)、(0.93±0.08)。實(shí)驗(yàn)組+抑制劑p-Akt/Akt及OD值明顯低于實(shí)驗(yàn)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.419、4.315，P=0.000、0.013)。見圖3。

圖3 Western印跡檢測(cè)Akt、p-Akt蛋白表達(dá)

2.5Akt信號(hào)通路抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡影響 實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)組+抑制劑細(xì)胞凋亡率依次為：(9.87±0.54)%、(14.95±0.47)%。實(shí)驗(yàn)組+抑制劑細(xì)胞凋亡率明顯高于實(shí)驗(yàn)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.291，P=0.000)。見圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

3 討 論

生長(zhǎng)激素釋放肽是1型糖尿病診斷的重要標(biāo)志物，是胰島素治療是否有效的重要標(biāo)志〔8〕。生長(zhǎng)激素釋放肽在2型糖尿病患者的正常后代中的水平異常降低；而低水平的生長(zhǎng)激素釋放肽與胰島素抵抗具有相關(guān)性，還調(diào)控人體內(nèi)胰島素的濃度〔9～11〕。糖尿病患者中存在胰島β細(xì)胞的大量喪失，而喪失的大部分胰島β細(xì)胞主要以細(xì)胞凋亡的方式減少〔12～16〕。糖尿病以胰島素治療和增加胰島β細(xì)胞生物學(xué)功能為主要治療手段，而促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖和減少凋亡是治療糖尿病的基礎(chǔ)之一〔17〕。Ma等〔18〕構(gòu)建了糖尿病大鼠模型，用生長(zhǎng)激素釋放肽灌胃處理后，大鼠的認(rèn)知功能有所改善，胰島素抵抗減弱。Wang等〔19〕研究表明，高脂高糖環(huán)境下胰島β細(xì)胞經(jīng)過生長(zhǎng)激素釋放肽作用后細(xì)胞中促凋亡蛋白表達(dá)水平下降。本研究結(jié)果顯示，高糖環(huán)境下胰島β細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞增殖能力降低，而經(jīng)過生長(zhǎng)激素釋放肽能夠部分逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)胰島β細(xì)胞的增殖抑制作用和凋亡促進(jìn)作用。本研究結(jié)果同之前的研究報(bào)道相符合，均說明生長(zhǎng)激素釋放肽能夠抑制高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的發(fā)生是一種生物學(xué)現(xiàn)象，是受到多種基因嚴(yán)格調(diào)控的過程，是細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路復(fù)雜調(diào)控的最終結(jié)果〔20，21〕。Akt信號(hào)通路廣泛存在于生命機(jī)體內(nèi)，在胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、組織器官形成等過程中均發(fā)揮重要作用，除此之外，Akt信號(hào)通路還參與動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、腦缺血再灌注、癌癥、糖尿病等多種疾病的發(fā)生過程，能夠調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡〔22～26〕。研究報(bào)道稱，Akt基因缺失的小鼠容易發(fā)生2型糖尿病，小鼠胰島β細(xì)胞數(shù)目異常減少，在糖尿病患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)Akt基因發(fā)生突變〔27，28〕。劉亮等〔29〕研究表明，軟脂酸能夠通過調(diào)控Akt的磷酸化水平促進(jìn)小鼠胰島β細(xì)胞凋亡。Wijesekara等〔30〕用Akt信號(hào)通路抑制劑作用于高糖環(huán)境下的胰島β細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率較單純高糖培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞凋亡率升高1倍。這些研究結(jié)果均表明，Akt信號(hào)通路參與胰島β細(xì)胞凋亡過程。

本研究結(jié)果顯示，高糖作用后的胰島β細(xì)胞中Akt磷酸化水平降低，而生長(zhǎng)激素釋放肽處理后胰島β細(xì)胞中Akt磷酸化水平有所升高。本研究還進(jìn)一步用Akt信號(hào)通路抑制劑處理生長(zhǎng)激素釋放肽預(yù)處理后的胰島β細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰島β細(xì)胞的增殖能力降低，凋亡增加。這提示，在高糖環(huán)境下，Akt信號(hào)通路抑制劑能夠減弱生長(zhǎng)激素釋放肽對(duì)胰島β細(xì)胞的增殖促進(jìn)和凋亡抑制作用。

綜上所述，生長(zhǎng)激素釋放肽能夠通過調(diào)控Akt信號(hào)通路抑制高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡和增殖抑制作用。本研究為進(jìn)一步研究生長(zhǎng)激素釋放肽對(duì)胰島β細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為探討生長(zhǎng)激素釋放肽在糖尿病治療中的作用奠定了基礎(chǔ)。本研究只在體外探討了生長(zhǎng)激素釋放肽和Akt信號(hào)通路在胰島β細(xì)胞凋亡中的作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會(huì)對(duì)生長(zhǎng)激素釋放肽與其他凋亡相關(guān)信號(hào)通路在胰島β細(xì)胞凋亡中的作用做更為全面的研究。