王翰華 楊曉春 陳云

(1浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江 寧波 315100；2浙江大學(xué))

枇杷葉是一味傳統(tǒng)中藥，有化痰止咳、降逆止嘔的功效〔1〕，具有抗炎止咳降血糖、抗癌、抗氧化、保肝等多種作用〔2〕；枇杷花味淡，性溫，可入肺散寒，化痰止咳，治療傷風(fēng)感冒等癥〔3〕。寧海白枇杷是浙江省寧海縣引進(jìn)白沙枇杷，在獨(dú)特的地方小氣候環(huán)境中，經(jīng)過多年實(shí)生優(yōu)育的新品種，具有果形大、糖度高、風(fēng)味濃郁等特點(diǎn)。2004年，寧海白枇杷被國家林業(yè)局認(rèn)定為國家級(jí)林木推廣良種〔4〕。近年，寧海白枇杷在浙東、浙南等地大量栽種，其質(zhì)優(yōu)果售價(jià)達(dá)40～100元/kg，經(jīng)濟(jì)效益顯著，成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民收入的主要來源。然而關(guān)于寧海白枇杷藥用研究的報(bào)道幾乎沒有。本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)物模型觀察寧海白枇杷花醇提物不同極性部位的止咳化痰抗炎活性，為進(jìn)一步開發(fā)利用寧海白藥用資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 方法與材料

1.1儀器 JP-300B型中藥粉碎機(jī)(永康市久品工貿(mào)有限公司)；DHG-9053A型鼓風(fēng)干燥箱(寧波江南儀器廠)；402AI型超聲霧化器〔江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司，蘇食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2007第2230016號(hào)〕；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海之信儀器有限公司)；BS124S型電子分析天平〔賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司〕；KQ-100B型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TU-1818型紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～22 g；豚鼠，雌雄兼用，體重160～200 g。均購于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(浙)2012-0178。

1.3藥材與試劑 寧海白枇杷花采自寧海縣一市鎮(zhèn)，經(jīng)我校中藥學(xué)院楊雄志教授鑒定，為薔薇科枇杷Eriobotryajaponica(Thumb.)Lindl.的花；強(qiáng)力枇杷露(杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：141025)；三黃片(河南省宛西制藥股份有限公司，批號(hào)：140823)；所用試劑均為分析純。

1.4寧海白枇杷花醇提物的制備 取寧海白枇杷花粉末1 000 g，加6倍量75%乙醇，90℃回流提取2 h，過濾，重復(fù)2次，合并濾液，濃縮，即得。

1.5提取物不同極性部位的制備 將上述提取物溶于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取液經(jīng)濃縮后，水浴蒸干，分別得到石油醚部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏、正丁醇部位浸膏和水部位浸膏。

1.6實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1氨水引咳試驗(yàn) 將昆明種小鼠進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)〔3〕，篩選出一批體重18～22 g的合格小鼠。待小鼠穩(wěn)定3 d后，取合格小鼠140只，雌雄各半，隨機(jī)分為14組，每組10只，分別為空白對照組(生理鹽水)，石油醚部位高(4 g/kg)、中(2 g/kg)、低劑量組(1 g/kg)，乙酸乙酯部位高(4 g/kg)、中(2 g/kg)、低劑量組(1 g/kg)，正丁醇部位高(4 g/kg)、中(2 g/kg)、低劑量組(1 g/kg)，水部位高(4 g/kg)、中(2 g/kg)、低劑量組(1 g/kg)和強(qiáng)力枇杷露陽性對照組(10 ml/kg)，連續(xù)灌胃給藥7 d(劑量0.2 ml/10 g)，于末次給藥1 h后，將小鼠置于自制密閉玻璃鐘罩內(nèi)，超聲霧化器噴入氨水，時(shí)間20 s，隨后立即取出小鼠，記錄小鼠咳嗽潛伏時(shí)間和2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)。

1.6.2枸櫞酸引咳試驗(yàn) 將豚鼠進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)〔3〕，篩選出合格豚鼠140只，分組及干預(yù)方式同1.6.1。每組灌胃給藥(劑量為0.2 ml/10 g)，連續(xù)7 d，于末次給藥1 h后，將豚鼠放入自制密閉玻璃鐘罩內(nèi)，超聲霧化噴入17.5%枸櫞酸，時(shí)間30 s，記錄豚鼠咳嗽潛伏期及5 min內(nèi)咳嗽次數(shù)。

1.6.3酚紅排泌試驗(yàn) 取昆明種小鼠140只，雌雄各半，分組及干預(yù)方式同1.6.1。每組灌胃給藥，連續(xù)7 d，末次給藥30 min后，于小鼠腹腔注射0.5 ml 0.5%苯酚紅溶液，30 min后處死小鼠，分離氣管段，加入4 ml生理鹽水和1 mol/L的氫氧化鈉溶液0.1 ml，546 nm波長處測得吸光度A，由標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算酚紅排出量。

1.6.4小鼠耳腫脹試驗(yàn) 取昆明種小鼠140只，雌雄各半，隨機(jī)分為14組，每組10只，分別為空白對照組(生理鹽水)，石油醚部位高(4 g/kg)、中(2 g/kg)、低劑量組(1 g/kg)，乙酸乙酯部位高(4 g/kg)、中(2 g/kg)、低劑量組(1 g/kg)，正丁醇部位高(4 g/kg)、中(2 g/kg)、低劑量組(1 g/kg)，水部位高(4 g/kg)、中(2 g/kg)、低劑量組(1 g/kg)和三黃片陽性對照組(0.4 g/kg)。灌胃給藥，連續(xù)5 d，于末次給藥1 h后，每只小鼠右耳精密滴加0.05 ml二甲苯，左耳不處理，30 min后處死小鼠，用打孔器取下左、右耳片，分別稱重，以兩耳重量之差值表示腫脹度，計(jì)算抑制率。抑制率(%)=(1-給藥組兩耳重量之差/對照組兩耳重量之差)×100%。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1對小鼠氨水引咳的影響 寧海白枇杷花醇提物不同極性部位對小鼠氨水引咳的影響，見表1。與空白對照組比較，強(qiáng)力枇杷露陽性對照組，正丁醇部位高、中、低劑量組和水部位高劑量組均能顯著延長小鼠咳嗽潛伏期，并顯著減少小鼠咳嗽次數(shù)(P<0.05)。

表1 對小鼠氨水引咳的影響

與空白對照組比較:1)P<0.05，下表同

2.2對豚鼠枸櫞酸引咳的影響 見表2。與空白對照組比較，強(qiáng)力枇杷露陽性對照組，正丁醇部位各劑量組和水部位高劑量組對豚鼠咳嗽潛伏期和咳嗽次數(shù)均顯著改善(P<0.05)，而石油醚部位和乙酸乙酯部位對豚鼠咳嗽潛伏期和咳嗽次數(shù)的影響并不明顯(P>0.05)。

表2 對豚鼠枸櫞酸引咳的影響

2.3對小鼠酚紅排泌的影響 與空白對照組比較，強(qiáng)力枇杷露陽性對照組，正丁醇部位高、中、低劑量組中小鼠氣管酚紅排泌量均顯著增加(P<0.05)，而石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位對小鼠氣管酚紅排泌量影響并不明顯(P>0.05)，說明寧海白枇杷花醇提取的正丁醇部位有良好的化痰活性，見表3。

表3 對小鼠酚紅排泌的影響

2.4對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 與空白對照組比較，三黃片陽性對照組和正丁醇部位高、中劑量組均能降低二甲苯引起的小鼠耳腫脹度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而其他組對二甲苯引起的小鼠耳腫脹度的影響不明顯(P>0.05)，表明寧海白枇杷花醇提取的正丁醇部位有較好的抗炎活性，見表4。

表4 對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

3 討 論

小鼠氨水引咳法和豚鼠枸櫞酸引咳法，小鼠酚紅排泌法及小鼠耳腫脹法是目前比較成熟的用于評(píng)估藥物止咳，化痰和抗炎的藥理模型〔5～9〕。本研究表明，寧海白枇杷花提取物中正丁醇部位可明顯延長小鼠和豚鼠的咳嗽潛伏期及減少咳嗽次數(shù)；顯著增加小鼠呼吸道黏膜酚紅的排泌量；對二甲苯致急性炎癥反應(yīng)有良好的抑制作用，是其止咳化痰抗炎的主要活性部位。枇杷花的有效成分和枇杷葉相似，主要為齊墩果酸和熊果酸等三萜類皂苷。三萜類皂苷在正丁醇中有較大的溶解度〔10〕。這和我們的研究結(jié)果相吻合。下一步可對乙醚部位進(jìn)行分離和成分鑒定，明確其主要活性成分，并揭示作用機(jī)制。另一方面，因?qū)幒０阻凌似け《嘀?，果大酸甜，市售價(jià)較普通枇杷高了1倍多，近年寧海白枇杷的種植區(qū)域逐漸擴(kuò)大，種植面積不斷增大。然而關(guān)于寧海白枇杷藥用研究的報(bào)道還相對匱乏。本實(shí)驗(yàn)考察了寧海白枇杷花醇提物不同極性部位的止咳化痰抗炎活性，為進(jìn)一步開發(fā)利用寧海白相關(guān)藥用資源打下基礎(chǔ)。