趙海軍 王澤陽(yáng) 王娟

(1石家莊市第四醫(yī)院乳腺科，河北 石家莊 050011；2河北省人民醫(yī)院腫瘤科)

乳腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)〔1〕，基因治療乳腺癌成為研究熱點(diǎn)。脂筏結(jié)構(gòu)蛋白(FLOT)在生物體中廣泛存在，且高度保守，參與細(xì)胞黏附、多種信號(hào)通路、軸突生長(zhǎng)、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等，包含兩種同源亞型，即FLOT1和FLOT2〔2〕。研究表明，多種腫瘤中FLOT1表達(dá)上調(diào)，如食管癌、肺癌、乳腺癌等，其表達(dá)與腫瘤進(jìn)展、預(yù)后等密切相關(guān)〔3～5〕。也有研究指出，抑制FLOT1表達(dá)可降低乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，如miR-124可靶向抑制FLOT1降低乳腺癌細(xì)胞的增殖及遷移能力〔6〕；敲除FLOT1可降低乳腺癌細(xì)胞的增殖及成瘤能力〔7〕。RNA干擾(RNAi)技術(shù)是一種在轉(zhuǎn)錄后抑制基因表達(dá)的新技術(shù)，能高效、特異的抑制目的基因表達(dá)，已成為病毒性疾病和腫瘤治療、基因功能研究等的有力工具〔8,9〕。本研究旨在探討不同乳腺癌細(xì)胞FLOT1的表達(dá)，通過(guò)RNAi技術(shù)抑制其表達(dá)，觀察細(xì)胞的凋亡情況。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購(gòu)自美國(guó)Gibco；AG490購(gòu)自美國(guó)Sigma；Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自上海博古生物；FLOT1、磷酸化蛋白酪氨酸激酶(p-JAK)2、p-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子(STAT3)、細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2和GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)CST；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD。

1.2細(xì)胞及培養(yǎng) 正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A及乳腺癌 MCF7、MDA-MB-231和HCC1569細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)ATCC。細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后在含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中，于5%體積分?jǐn)?shù)CO2、95%飽和濕度培養(yǎng)箱中37℃常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)為生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞。

1.3Western印跡法 放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液適量提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白，蛋白上樣(每孔道40 μg)后行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白分離后，通過(guò)電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉轉(zhuǎn)好的膜1 h，洗膜，加稀釋好的一抗(1∶500稀釋的p-JAK2、p-STAT3、PCNA、Bcl-2及內(nèi)參GAPDH)，4℃搖床孵育過(guò)夜，洗膜，加1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗體，室溫孵育1 h，洗膜，電化學(xué)發(fā)光顯影、定影。Bio-Rad化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)及配套的軟件采集圖像。GAPDH為內(nèi)參蛋白，以p-JAK2、p-STAT3、PCNA和Bcl-2與GAPDH的灰度值比值作為各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4siRNA設(shè)計(jì)及轉(zhuǎn)染 按照siRNA設(shè)計(jì)原則及方法，設(shè)計(jì)針對(duì)FLOT1的特異性siRNA序列(si-FLOT1組)及陰性對(duì)照siRNA序列(NC組)，序列如下(僅列出正義鏈)：si-FLOT1：5′-CCCTCAATGTCAAGAGTGAAA-3′；NC：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。序列經(jīng)基本局部比對(duì)搜索工具(BLAST)同源比較分析后顯示與其他人類(lèi)基因序列無(wú)同源性。并由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。轉(zhuǎn)染前1 d接種MDA-MB-231細(xì)胞(1×105個(gè)/孔)于6孔板，細(xì)胞達(dá)70%～80%生長(zhǎng)密度時(shí)，將制備的siRNA-Lip2000混合物加入至6孔板，僅僅加入脂質(zhì)體的為空白對(duì)照組，10 μmol/L AG490作為STAT3信號(hào)通路抑制劑(si-FLOT1+AG490組)。轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000說(shuō)明，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5～6 h，換為不含抗生素的培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，檢測(cè)3組細(xì)胞FLOT1的蛋白表達(dá)。

1.5細(xì)胞凋亡檢測(cè) 收集si-FLOT1轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞48 h的3組細(xì)胞，制備成為單細(xì)胞懸液，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，離心，棄掉上清，冷卻的1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105個(gè)/ml，于冰上避光條件下分別加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI的稀釋液，繼續(xù)避光培養(yǎng)10～15 min，再加入冷卻的1×結(jié)合緩沖液400 μl，30 min內(nèi)上機(jī)，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1乳腺癌細(xì)胞FLOT1的表達(dá) FLOT1在乳腺癌細(xì)胞MCF7(0.306±0.028)、MDA-MB-231(0.437±0.039)和HCC1569(0.334±0.031)中的蛋白表達(dá)均高于正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A(0.118±0.013，F(xiàn)=61.809，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 乳腺癌細(xì)胞中FLOT1蛋白表達(dá)電泳

2.2FLOT1 siRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞效果 si-FLOT1組FLOT1的蛋白表達(dá)(0.101±0.010)顯著低于空白對(duì)照組(0.506±0.045，P<0.05)，而NC組FLOT1的蛋白表達(dá)(0.518±0.048)與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 FLOT1 siRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后FLOT1蛋白表達(dá)電泳

2.3FLOT1 siRNA轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡 與NC組〔(4.71±0.38)%〕比較，si-FLOT1組細(xì)胞凋亡率〔(28.29±2.51)%〕顯著升高(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞凋亡率為(4.54±0.32)%，見(jiàn)圖3。

2.4FLOT1 siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞STAT3信號(hào)表達(dá) 與NC組比較，si-FLOT1組p-JAK2、p-STAT3、PCNA和Bcl-2的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表1，圖4。

圖3 FLOT1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

組別p-JAK2p-STAT3PCNABcl-2空白對(duì)照組0.106±0.0100.124±0.0150.389±0.0360.296±0.032NC組0.118±0.0130.136±0.0160.402±0.0400.284±0.030si-FLOT1組0.041±0.0071)0.055±0.0081)0.187±0.0211)0.169±0.0181)F/P值48.576/0.00031.558/0.00139.196/0.00019.683/0.002

與NC組比較：1)P<0.05

圖4 FLOT1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3、PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

2.5抑制STAT3信號(hào)增加FLOT1 siRNA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo) 與si-FLOT1組〔(25.62±1.48)%〕比較，si-FLOT1+AG490組細(xì)胞凋亡率〔(36.25±2.18)%〕顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5 抑制STAT3信號(hào)增加FLOT1 siRNA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)

3 討 論

FLOT1與細(xì)胞黏附、細(xì)胞內(nèi)吞、細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)等存在密切關(guān)系，主要通過(guò)將各種細(xì)胞信號(hào)通路的胞膜受體錨定在細(xì)胞膜上發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)媒介的作用〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤中FLOT1出現(xiàn)異常表達(dá)，如膀胱癌中FLOT1呈高表達(dá)，可增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，并與膀胱癌的分級(jí)、分期、復(fù)發(fā)顯著相關(guān)〔11〕；舌癌中FLOT1呈高表達(dá)，與患者預(yù)后密切相關(guān)〔12〕；乳腺癌中FLOT1表達(dá)也明顯增強(qiáng)，與腫瘤分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理特征顯著相關(guān)，下調(diào)FLOT1表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖〔7〕。而目前關(guān)于FLOT1對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究尚未明確。本研究提示FLOT1表達(dá)抑制可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。

STAT3是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號(hào)途徑，在人及鼠的多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)出過(guò)度表達(dá)或激活，如乳腺癌、白血病、肺癌等，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展，因此被稱(chēng)為癌基因，阻斷腫瘤STAT3信號(hào)通路已成為一種治療方法〔13～15〕。STAT3的異?；罨c上游JAK調(diào)節(jié)異常有關(guān)，AG490為JAK激酶抑制劑，可通過(guò)抑制JAK活化，進(jìn)而影響STAT的激活。研究顯示，AG490不能誘導(dǎo)正常乳腺細(xì)胞凋亡，而可抑制STAT3在乳腺癌細(xì)胞的活化，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡〔16〕。但STAT3并不直接引起腫瘤發(fā)生，而是通過(guò)調(diào)節(jié)一些與增殖、凋亡等相關(guān)的因子表達(dá)而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。PCNA是一個(gè)分子量為36 kD的非組蛋白，與細(xì)胞增殖有密切關(guān)系，是合成DNA不可缺少的因子，在包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中表達(dá)升高，已成為檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)〔17,18〕。Bcl-2發(fā)揮抑凋亡作用，下調(diào)其表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡〔19〕。本研究提示FLOT1表達(dá)抑制誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡與下調(diào)STAT3信號(hào)有關(guān)。

綜上，F(xiàn)LOT1在乳腺癌細(xì)胞高表達(dá)，通過(guò)RNAi抑制其表達(dá)可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，機(jī)制與下調(diào)STAT3信號(hào)通路有關(guān)。