任彬彬 宋曉磊 劉永濤 劉飛來 馮曉東

(河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院康復科，河南 鄭州 450000)

頸椎病的發(fā)病基礎(chǔ)是椎間盤的退行性改變，大量研究表明，椎間盤細胞凋亡過度是引起椎間盤細胞數(shù)量減少的主要原因，而其數(shù)量減少可加速椎間盤的退變及衰老〔1〕。氧化應激是引起細胞發(fā)生凋亡的一個重要環(huán)節(jié)，有多項研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫(H2O2)可誘導椎間盤纖維環(huán)細胞凋亡〔2〕。葛根素是從中藥葛根中提取出來的主要有效成分，具有抗氧化、擴張血管、修復內(nèi)皮細胞損傷、改善微循環(huán)等藥理作用，目前對椎間盤纖維環(huán)細胞的影響研究較少〔3〕。有研究顯示，葛根素可呈劑量依賴性抑制Fas配體誘導的椎間盤纖維環(huán)細胞壞死〔4〕，葛根素可降低白細胞介素(IL)-1β誘導的椎間盤纖維環(huán)細胞凋亡〔5〕，但其對H2O2誘導的椎間盤纖維環(huán)細胞凋亡影響及機制尚未明確。本研究使用H2O2建立大鼠椎間盤纖維環(huán)細胞凋亡模型，檢測葛根素對其凋亡的影響，并進一步研究其作用機制。

1 材料方法

1.1實驗動物 SPF級SD大鼠2只，體質(zhì)量120 g左右，雌雄不限，由河南省實驗動物中心實驗動物中心提供。

1.2主要試劑和儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自美國Hyclone；葛根素購自國藥集團化學試劑有限公司；噻唑藍(MTT)試劑、二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)均購自美國Sigma；Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒購自南京凱基；Wnt1、β-catenin、糖原合成酶激酶(GSK)-3β和Bax抗體均購自美國CST；酶標儀購自美國Thermo；流式細胞儀購自美國BD。

1.3大鼠頸椎間盤纖維環(huán)細胞的原代培養(yǎng) 無菌條件下取下大鼠的頸椎間盤纖維環(huán)，采用連續(xù)的酶消化法進行分離、培養(yǎng)〔6〕。原代培養(yǎng)的細胞經(jīng)3～4次(9～12 d)換液后，顯微鏡下觀察到細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%～90%的面積時用胰蛋白酶消化后傳代。

1.4細胞活力檢測 大鼠的頸椎間盤纖維環(huán)細胞分為3個處理組，即對照組、H2O2組和葛根素組。 取第3代頸椎間盤纖維環(huán)細胞，以每孔4×103～5×103細胞密度接種于96孔板，觀察到細胞貼壁后，將上清液棄掉，洗去未貼壁的細胞，對照組不做任何處理，H2O2組用200 μmol/L的H2O2組處理24 h，葛根素組首先用1 g/L的葛根素處理24 h后，再用200 μmol/L的H2O2處理細胞24 h。收集處理至規(guī)定時間的細胞，每孔中加入20 μl的MTT溶液(5 g/L)，于37℃條件下孵育4 h，加二甲基亞砜(DMSO)溶液150 μl于每孔中，震蕩混勻10 min，于490 nm處，酶標儀測定各個孔的吸光度值(A值)。實驗重復3次。

1.5細胞凋亡檢測 取第3代頸椎間盤纖維環(huán)細胞，以3×105/孔密度接種于6孔板，于含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，觀察到細胞長滿80%后，按照上述分組處理細胞，收集處理至規(guī)定時間的細胞，預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，胰酶消化后收集細胞，1×結(jié)合緩沖液重懸細胞，加AnnexinV-FITC 5 μl和PI 10 μl，避光環(huán)境孵育15 min，再加入1×結(jié)合緩沖液400 μl，1 h內(nèi)流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.6活性氧(ROS)水平檢測 取第3代頸椎間盤纖維環(huán)細胞，以2.5×105/孔密度接種于6孔板，細胞貼壁48 h后，按照上述分組處理細胞，收集處理至規(guī)定時間的細胞，加入用DMEM/F12稀釋后配置成終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA工作液，于37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，細胞孵育期間，每間隔4 min適當震蕩混勻一次，以使細胞能與DCFH-DA充分接觸。孵育完成后，離心，收集細胞，DMEM/F12洗滌及重懸細胞，通過流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.7Western印跡 收集處理至規(guī)定時間的3組細胞，放射免疫沉淀(RIPA)裂解液提取細胞總蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法定量蛋白，每孔道上樣40 μg總蛋白，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電脈(SDS-PAGE)，蛋白分離后電轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(PVDF)膜后用5%的脫脂奶粉封閉2 h，洗膜，加稀釋好的一抗，即1∶500稀釋的Wnt1、β-catenin、GSK-3β和Bax抗體，37℃搖床孵育過夜，加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫孵育1 h，電化學發(fā)光(ECL)顯影定量。Bio-Rad化學發(fā)光成像系統(tǒng)及配套的軟件采集圖像。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值作為各蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.8抑制Wnt信號通路后大鼠頸椎間盤纖維環(huán)細胞活力及凋亡檢測 葛根素或Wnt信號通路激活劑氯化鋰(LiCl，10 μmol/L)分別處理經(jīng)H2O2刺激的大鼠頸椎間盤纖維環(huán)細胞，細胞分為葛根素組和葛根素+LiCl組，參照上述方法檢測細胞活力及凋亡率。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析和組間兩兩比較SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1葛根素對H2O2誘導的大鼠頸椎間盤纖維環(huán)細胞活力的影響 H2O2組細胞活力(0.241±0.020)顯著低于對照組(0.492±0.037)(P<0.05)，而葛根素組細胞活力(0.375±0.032)顯著高于H2O2組(P<0.05)；3組差異顯著(F=50.830，P=0.000)。

2.2葛根素對H2O2誘導的大鼠頸椎間盤纖維環(huán)細胞凋亡的影響 見圖1。

H2O2可誘導大鼠頸椎間盤纖維環(huán)細胞凋亡(32.28%±3.11%)，與對照組(5.02%±0.31%)比較差異顯著(P<0.05)，而葛根素可明顯抑制由H2O2誘導的細胞凋亡(15.76%±1.02%)，且與H2O2組比較差異顯著(P<0.05)；3組差異顯著(F=157.009，P=0.000)。

2.3葛根素對H2O2誘導的大鼠頸椎間盤纖維環(huán)細胞ROS水平的影響 H2O2組細胞ROS水平(2.67±0.28)顯著高于對照組(1.00±0.00)(P<0.05)，而葛根素組細胞ROS水平(1.54±0.16)顯著低于H2O2組(P<0.05)。

2.4葛根素對H2O2誘導的大鼠頸椎間盤纖維環(huán)細胞Wnt信號通路的影響 H2O2組Wnt1、β-catenin和GSK-3β的蛋白表達均顯著低于對照組，Bax蛋白表達顯著高于對照組(P<0.05)，葛根素組Wnt1、β-catenin和GSK-3β蛋白表達顯著高于對照組，Bax蛋白表達顯著低于對照組(P<0.05)。見圖2和表1。

圖2 葛根素對H2O2誘導的大鼠頸椎間盤纖維環(huán)細胞Wnt信號通路的影響

組別Wnt1β-cateninGSK-3βBax對照組0.822±0.0740.303±0.0280.287±0.0310.089±0.009H2O2組0.257±0.0321)0.154±0.0161)0.101±0.0101)0.251±0.0291)葛根素組0.667±0.0592)0.274±0.0302)0.172±0.0202)0.149±0.0162)F/P值76.849/0.00033.295/0.00154.273/0.00041.322/0.000

與對照組比較：1)P<0.05；與 H2O2組比較：2)P<0.05

2.5激活Wnt信號通路對H2O2誘導的大鼠的頸椎間盤纖維環(huán)細胞活力及凋亡率的影響 葛根素+LiCl組細胞活力(0.462±0.035)顯著高于葛根素組(0.356±0.028；t=4.096，P=0.015)，細胞凋亡率(4.32%±0.55%)顯著低于葛根素組(16.24%±1.07%；t=17.161,P=0.000)。見圖3。

圖3 激活Wnt信號通路對H2O2誘導的大鼠頸椎間盤纖維環(huán)細胞凋亡率的影響

3 討 論

椎間盤退變是一種常見的疾病，受多環(huán)節(jié)、多因素的影響，引起細胞衰老主要有兩方面的原因，即應激誘導早衰和復制老化，前者是在H2O2、高氧、慢性炎癥等一些亞致死性應激下細胞發(fā)生的提前衰老，其中氧化應激可直接損傷DNA，進而導致細胞的早衰〔7，8〕。有研究表明，H2O2可誘導椎間盤纖維環(huán)細胞凋亡，且200 μmol/L以上的H2O2可明顯抑制椎間盤髓核細胞活力〔9〕，葛根有生物堿、多種異黃酮等多種活性成分，具有改善骨代謝、抑制炎癥介質(zhì)活性、改善微循環(huán)等藥理作用，葛根素屬于異黃酮類成分，是葛根的一個單體有效成分，其大部分藥理作用與葛根相同，且有基礎(chǔ)研究證實葛根素可減緩骨質(zhì)增生、改善骨代謝及減緩骨質(zhì)疏松等，且可抑制心肌細胞、腦細胞等的凋亡〔10，11〕。研究顯示，葛根素可能從增加轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1和降低基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3的角度，影響椎間盤細胞外基質(zhì)合成和降解，進而延緩椎間盤退變〔12〕；葛根素(0.01～1.00 g/L)可呈劑量依賴性抑制Fas配體誘導的椎間盤纖維環(huán)細胞壞死〔4〕。本研究結(jié)果顯示，H2O2可抑制大鼠椎間盤纖維環(huán)細胞活力，誘導細胞凋亡，而葛根素可提高椎間盤纖維環(huán)細胞活力，抑制細胞凋亡，這提示葛根素對氧化應激引起的椎間盤纖維環(huán)細胞損傷具有保護作用。

ROS是指氧的某些代謝產(chǎn)物和一些反應的含氧產(chǎn)物，其產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡，當機體處在氧化應激狀態(tài)下，可提高ROS在組織細胞的水平，其產(chǎn)生大于清除時，可導致機體的損傷〔13，14〕。本研究結(jié)果提示葛根素對椎間盤退變保護機制可能與降低細胞ROS水平有關(guān)。Wnt信號通路是一條參與細胞增殖、凋亡等過程調(diào)控的重要信號途徑，有研究表明，Wnt信號通路可對類風濕關(guān)節(jié)炎患者的成骨細胞、破骨細胞、成纖維細胞等發(fā)揮效應，從而對骨質(zhì)侵蝕及骨質(zhì)疏松起促進作用〔15，16〕。Wnt/β-catenin信號在椎間盤細胞中被抑制后，可降低細胞增殖，加快細胞老化進程，從而促進椎間盤退變〔17〕。研究表明，Wnt的激活可抑制椎間盤纖維環(huán)細胞凋亡〔18〕。本研究結(jié)果顯示，葛根素可上調(diào)Wnt信號通路Wnt1、β-catenin、GSK-3β表達，下調(diào)凋亡相關(guān)的Bax表達，且葛根素與Wnt信號通路激活劑LiCl合用對椎間盤纖維化細胞活力促進及凋亡抑制作用強于葛根素，這提示葛根素對椎間盤纖維化細胞生長的影響可能與Wnt信號有關(guān)。

綜上，葛根素可降低由H2O2誘導的頸椎間盤纖維環(huán)細胞凋亡，機制與細胞內(nèi)ROS水平降低及激活Wnt信號通路有關(guān)。本研究可能為椎間盤退變治療提供了一定的理論基礎(chǔ)，但未進行體內(nèi)實驗，還需深入探究。