張黎 武俊紫，2 牛世偉，2 李燕 李樹德

(1云南省第一人民醫(yī)院干部保健科，云南 昆明 650032；2昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院；3昆明醫(yī)科大學生物化學與分子生物學系)

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是由于肝細胞脂質(zhì)代謝障礙所致，目前認為致病因素很多，全身代謝性氧化應激反應是其中之一〔1〕。而NAFLD后續(xù)可發(fā)展為肝纖維化、肝硬化使肝功能進一步惡化，甚至發(fā)生癌變，縮短患者壽命〔2〕。多項研究〔3，4〕提示15%～50%的肝纖維化和肝硬化與脂肪肝有關(guān)，因此NAFLD已經(jīng)成為一種普遍威脅人們健康的疾病，對它的預防和治療已成為重要問題，而目前針對這一疾病還沒有特效治療藥物。谷氨酰胺(Gln)是一種哺乳動物非必需氨基酸，近年研究發(fā)現(xiàn)它具有多種功能，可改善脂質(zhì)代謝，增強抗炎癥、抗氧化能力等〔5〕。 為此本研究通過建立NAFLD大鼠模型，觀察給予NAFLD大鼠左旋-Gln(L-Gln)治療后血脂、肝功能的改變及對?；o酶A氧化酶(ACOX)1及硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)1表達的影響，探討L-Gln對NAFLD大鼠血脂及肝功能是否有改善及其作用機制。

1 材料與方法

1.1動物來源及分組 雄性SD大鼠70只，隨機選取20只作為空白對照組(CON組)，喂食普通飼料，其余50只大鼠給高脂飼料喂養(yǎng)，進行NAFLD 大鼠造模，12 w后隨機選取10只檢驗造模是否成功。造模成功大鼠分為：NAFLD模型組(NAF組)20只，喂食高脂飼料；L-Gln治療組(L-Gln組)20只，喂食高脂飼料，同時給予大鼠L-Gln灌胃治療。

1.2藥品與試劑 L-Gln購于日本株式會社；肝功能、血脂等相關(guān)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購于Bio-Swamp公司；引物及總RNA提取試劑盒購于佰泰克生物科技股份有限公司，多克隆抗體ACOX1、多克隆抗體SCD1、單克隆抗體β-actin及ECL發(fā)光試劑盒購于美國Santa Cruz公司，二抗購于Invitrogen公司。

1.3方法

1.3.1NAFLD大鼠造模方法 參考國際通用的NAFLD造模飼料配方〔6〕配制高脂飼料，成分為20%豬油、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉加77.5%的普通飼料。給大鼠自由取食。12 w后處死大鼠，取大鼠肝臟組織行HE染色，見肝細胞極度腫脹，體積明顯增大，并且有不同程度的脂肪變性及空泡樣變，造模成功。

1.3.2大鼠給藥方法 L-Gln組大鼠給予L-Gln灌胃1 g/kg體重，NAF組給予生理鹽水灌胃參照，CON組不加以任何干涉，治療6 w和12 w分別處死各組大鼠10只，留取血清和肝臟等組織用于測定相應指標。

1.3.3標本采集 給大鼠10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉，將大鼠捆綁固定于解剖臺，無菌操作暴露腹腔，于心尖部取血10 ml；5 000 r/min離心，取上清液放入-80℃冰箱保存，肝臟組織取500 mg置于RNA保護液中，其余部分放入-80℃冰箱保存。

1.3.4相關(guān)指標檢測方法 總膽汁酸(TBA)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的測定方法為酶法，ALT、AST、TBIL、DBIL、UBIL測試方法為雙抗體夾心法。

1.3.5RT-PCR檢測ACOX1、SCD1 mRNA的表達 取RNA保護液中的肝臟組織30 mg，用Trizol法提取總RNA，定量后取2 μg反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以此為模板進行PCR反應，擴增目的片段。PCR擴增反應條件如下：98℃預變性2 min，98℃變性10 s、48℃退火30 s、72℃延伸35 s，循環(huán)次數(shù)34次；最后再延伸5 min。PCR反應產(chǎn)物點樣于1.6%瓊脂糖凝膠，110 V恒壓電泳30 min，電泳完成后凝膠成像儀拍照，Western印跡掃描后用Image J軟件進行統(tǒng)計分析。 ACOX1引物設計為：引物A：5′ GAGATGGATAACGGCTACCT 3′，引物B：5′AATTCCGTGAGCTCGGTGAC 3′，產(chǎn)物長度為190 bp。SCD1引物設計為：引物A：5′CATCGCCAACACCATGGCATT3′，引物B：5′TCTGGAACATCATCACCAGCTTCTC3′，產(chǎn)物長度為186 bp。β-actin引物設計為：引物A：5′GTGACGAGGCCCAGAGCAAGAG-3′，引物B：5′ACGCAGCTCATTGTAGAAGGTGTGG-3′，產(chǎn)物長度為123 bp。

1.3.6Western印跡檢測ACOX1、SCD1蛋白表達 取肝臟組織100 mg加入500 μl的RIPA裂解液制作勻漿，二甲基喹啉酸(BCA)法測定蛋白濃度，定量后取樣本60 μg進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)電泳，電泳結(jié)束后切取目標蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉(5%的脫脂牛奶)后加入相應多克隆一抗，4℃過夜，洗膜后加入二抗孵育2 h，洗滌后電化學發(fā)光，掃描圖像后用Image J軟件計算灰度值，每組實驗重復3次。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組肝功能比較 L-Gln組治療12 w較NAF組TBIL、DBIL及UBIL顯著降低，TP、ALB顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，TBA顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。L-Gln治療12 w較NAF組AST、ALT明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表1 治療12 w各組肝功能比較

與NAF比較：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

表2 治療12 w各組ALT、AST比較

2.2各組血脂水平比較 L-Gln組治療12 w較NAF組TC、TG、LDL-C明顯下降，HDL-C明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

2.3各組肝臟組織ACOX1與SCD1 mRNA表達比較 L-Gln治療12 w較NAF組大鼠肝臟ACOX1與SCD1 mRNA表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4，圖1。

表3 治療12 w各組血脂水平比較

表4 治療12 w各組肝組織ACOX1與SCD1 mRNA表達比較

圖1 各組肝臟組織ACOX1與SCD1 mRNA表達

2.4各組肝臟組織ACOX1與SCD1蛋白表達比較 L-Gln組治療12 w較NAF組大鼠肝臟ACOX1與SCD1蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2，表5。

圖2 各組肝臟組織ACOX1與SCD1蛋白表達

組別ACOX1SCD1CON組0.88±0.0520.95±0.032NAF組0.48±0.0410.64±0.045L-Gln組0.80±0.0461)0.86±0.0301)

3 討 論

NAFLD是指無過量飲酒、藥物或遺傳性疾病所致的肝細胞內(nèi)脂肪過度沉積導致肝細胞脂質(zhì)變性為主要特征的臨床綜合征，其包括單純性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關(guān)肝硬化等〔3〕。近些年來相關(guān)研究認為NAFLD的發(fā)病機制與高脂飲食導致肝臟脂肪過度堆積，脂肪酸氧化增多，產(chǎn)生大量的具有毒性的自由基，發(fā)生脂質(zhì)氧化應激反應，使肝細胞呈氣球樣變性并且發(fā)生炎癥反應。研究〔4,7〕提示肝纖維化、肝硬化可使肝功能進一步惡化，甚至惡變?yōu)楦伟?。L-Gln在體內(nèi)有多種作用，改善脂質(zhì)代謝，慢性降解脂肪是其中之一〔8〕。

有多項指標可以評價肝功能，AST和ALT是評價肝細胞受損的關(guān)鍵指標，當肝細胞膜損傷破裂時ALT、AST釋放入血，血中ALT、AST升高。UBIL、DBIL、TBA是評價肝細胞及肝膽管損傷的敏感指標，肝細胞受損時將UBIL轉(zhuǎn)化為DBIL的能力降低，使血中UBIL升高，而膽道損傷時排除障礙，血中的DBIL、TBA也會升高〔9，10〕。肝細胞功能損傷時合成ALB減少，則血中ALB、TP均減少。本研究結(jié)果提示NAFLD大鼠的肝功能受損、肝細胞破壞；經(jīng)過L-Gln治療12 w后NAF大鼠肝功能得到改善，且肝細胞未再進一步破壞，這提示L-Gln可能對NAFLD大鼠的肝細胞有保護作用，尤其對降低TBA有很積極的作用。SCD1是飽和脂肪酸-脂酰輔酶A的催化酶，同時也是肝細胞合成單不飽和脂肪酸的限速酶，可將肝細胞內(nèi)沉積的過量脂質(zhì)轉(zhuǎn)化生成油酸與棕桐油酸〔11〕，而油酸與棕桐油酸是合成膽固醇和TG的重要底物〔12〕。近年研究認為其可能參與了脂肪肝的發(fā)病，長期的高脂飲食引起大鼠肝臟SCD-1 mRNA和蛋白表達水平下降，使脂肪在肝細胞代謝障礙形成NAFLD〔13〕。1978年Osumi等〔13〕就發(fā)現(xiàn)ACOX1是脂肪細胞內(nèi)與脂肪酸氧化相關(guān)的酶，同時也是過氧化酶體內(nèi)β-氧化系統(tǒng)的起始酶。另有研究顯示〔14〕ACOX1基因缺乏小鼠可發(fā)生嚴重NASH。本研究顯示L-Gln可通過調(diào)節(jié)SCD1和ACOX1 mRNA表達激活目標基因SCD1和ACOX1的基因轉(zhuǎn)錄，同時增加其蛋白表達，促進肝臟脂肪代謝，減輕因高脂飲食引起的血脂升高，進而降低大鼠肝臟細胞脂肪含量，保護大鼠的肝功能及肝細胞膜完整性，從而達到治療NAFLD的目的。這可能是其治療NAFLD的分子機制。