張春秋 李慶華 李曉峰 楊莉

(1大慶油田總醫(yī)院普外科，黑龍江 大慶 163001；2大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科)

目前認(rèn)為腫瘤的發(fā)生與癌基因、抑癌基因、miRNA等異常表達(dá)有關(guān)，這也是目前基因靶向治療和miRNA靶向治療的研究重點(diǎn)〔1,2〕。miRNA是一種非編碼的RNA分子，目前已發(fā)現(xiàn)鑒定的人類miRNA已經(jīng)有1 000多種，可以調(diào)控多種基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的生物學(xué)特性〔3〕。miR-26b在脂肪細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞等多種細(xì)胞中均有表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生、子癇前期等疾病發(fā)生密切相關(guān)〔4～6〕。研究顯示，miR-26b參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞、肺癌細(xì)胞等多種細(xì)胞的凋亡過程，miR-26b在肝癌組織中低表達(dá)，并且與肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)〔7,8〕。本實(shí)驗(yàn)旨在明確miR-26b對(duì)肝癌細(xì)胞增殖分化凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 肝癌細(xì)胞SMMC-7721、HuH-7、HepG2和正常肝細(xì)胞HL-7702購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)；qRT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物；RNA提取試劑盒購(gòu)自北京Solarbio；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)SAB；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所；所用引物均由上海生物合成；β-連環(huán)蛋白(catenin)抗體、剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體購(gòu)自美國(guó)CTS；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen。

1.2qRT-PCR測(cè)定miR-26b在肝癌細(xì)胞中的表達(dá) 取處于對(duì)數(shù)期的肝癌細(xì)胞SMMC-7721、HuH-7、HepG2和正常肝細(xì)胞HL-7702，培養(yǎng)于含有100 mg/L鏈霉素、1×105U/L青霉素、10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為5% CO2、37℃培養(yǎng)箱。用TRIZOL試劑提取細(xì)胞中的總RNA，具體步驟同試劑盒說明書。提取的RNA樣品用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD260 nm/OD280 nm的比值。取RNA，用qRT-PCR擴(kuò)增，分析miR-26b表達(dá)水平。miR-26b上游 5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′，下游5′-GCGCTTCAAGTAATTCAGG-3′。U6上游 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR程序?yàn)椋?5℃ 10 min；95℃ 15 s；60℃ 60 s；72℃ 30 s,循環(huán)45次。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 SMMC-7721細(xì)胞接種到6孔板，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞鋪滿瓶底的60%左右時(shí)，把細(xì)胞培養(yǎng)液換成為不含血清的1640，孵育1 h。用Lipofectamine 2000將miR-26b mimic、mimic對(duì)照(control)分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，具體操作步驟同轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染后分別命名為miR-26b mimic組、mimic control組，把單純加入轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞作為Control組。在轉(zhuǎn)染以后48 h，用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-26b水平，步驟同上。

1.4CCK-8測(cè)定肝癌細(xì)胞增殖 Control、miR-26b mimic、mimic control組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染以后接種到96孔板內(nèi)，每個(gè)孔中添加2×104個(gè)細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染以后分別培養(yǎng)48 h，每孔中添加10 μl的CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h以后，以酶標(biāo)儀測(cè)定其在450 nm的OD值。存活率=100%×(轉(zhuǎn)染組OD值/Control OD值)

1.5流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定肝癌細(xì)胞凋亡 Control、miR-26b mimic、mimic control組細(xì)胞分別培養(yǎng)48 h以后，收集各組肝癌細(xì)胞，分別用4℃預(yù)冷后的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，放置于離心機(jī)中，1 800 r/min離心10 min。吸盡上清以后，依次加入結(jié)合緩沖液100 μl均勻混合，再分別加入Annexin V-FITC和PI，放在室溫避光條件反應(yīng)15 min，再在懸浮液中添加400 μl的結(jié)合緩沖液，充分混合，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6Western印跡檢測(cè)β-catenin、CyclinD1、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá) Control、miR-26b mimic、mimic control組細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后，在細(xì)胞中添加裂解液，在低溫4℃收集細(xì)胞，超聲破碎。蛋白樣品濃度檢測(cè)用BCA法，具體操作步驟同試劑盒。配制5%的濃縮膠和10%的分離膠。蛋白樣品在上樣前與等體積的上樣緩沖液混合后，在100℃煮沸5 min。每個(gè)上樣孔內(nèi)加入30 μg的蛋白樣品，在濃縮膠中用90 V的電壓電泳，在分離膠中用120 V的電壓電泳。將裁剪好的聚偏氟乙烯(PVDF)膜放在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡。以300 mA的電流將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜時(shí)間為50 min，轉(zhuǎn)膜溫度為4℃。轉(zhuǎn)膜結(jié)束以后，把PVDF膜放在含有5%牛血清白蛋白的平皿中，在室溫中孵育2 h。再把膜放在含有1∶600稀釋的一抗中，置于4℃中孵育過夜。再與1∶2 000稀釋的二抗在室溫中孵育2 h。以電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色以后，內(nèi)參為β-actin，分析各組各蛋白條帶的表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-26b在肝癌細(xì)胞中的表達(dá) miR-26b在肝癌細(xì)胞SMMC-7721(0.34±0.06)、HuH-7(0.57±0.08)、HepG2(0.48±0.05)中的表達(dá)水平均顯著低于正常肝細(xì)胞HL-7702(1.00±0.00)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-26b在肝癌細(xì)胞SMMC-7721中的表達(dá)水平顯著低于HuH-7、HepG2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。選用表達(dá)水平最低的SMMC-7721作為研究對(duì)象。

2.2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-26b表達(dá) mimic control組細(xì)胞中miR-26b表達(dá)水平與Control組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(0.97±0.13)vs(1.00±0.00)，P>0.05〕。miR-26b mimic組細(xì)胞中miR-26b 的表達(dá)水平(2.65±0.21)顯著高于Control組(P<0.05)。為后續(xù)研究提供條件。

2.3miR-26b對(duì)細(xì)胞增殖凋亡影響 mimic control組細(xì)胞存活率和凋亡率與Control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與Control組比較，miR-26b mimic組細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞存活率顯著降低(均P<0.05)。見圖1、表1。

2.4miR-26b對(duì)細(xì)胞中β-catenin、CyclinD1、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)的影響 與Control組比較mimic control組細(xì)胞中β-catenin、CyclinD1、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與Control組比較，miR-26b mimic組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)，β-catenin、CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05)。見圖2、表2。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定miR-26b對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡影響

組別存活率凋亡率Control組100.006.82±0.53mimic control組102.45±12.576.91±0.72miR-26b mimic組54.25±6.341)32.69±4.171)F值33.468110.006P值0.0010.000

與Control組比較：1)P<0.05；表2同

1：Control組；2：mimic control組；3:miR-26b mimic組圖2 Western印跡檢測(cè)β-catenin、CyclinD1、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)

組別β-cateninCyclinD1Cleaved Caspase-3BaxControl組0.97±0.150.45±0.060.16±0.030.44±0.05mimic control組0.96±0.140.43±0.080.17±0.040.43±0.07miR-26b mimic組0.47±0.061)0.21±0.021)0.45±0.061)0.98±0.101)F值16.09015.34639.98451.224P值0.0040.0040.0000.000

3 討 論

miRNA是一種內(nèi)源性的非編碼RNA，其可以與靶基因結(jié)合從而影響蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，miRNA對(duì)于細(xì)胞的分化、胚胎發(fā)育等均有重要作用，對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡等也具有重大意義〔9〕。miRNA與人類的多種疾病發(fā)生有關(guān)，如腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等疾病，研究表明，miRNA在腫瘤組織中異常表達(dá)，并且參與腫瘤的形成和發(fā)展，與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性發(fā)揮有關(guān)〔10～12〕。miR-26b作為一種miRNA，在乳腺癌、食管癌等多種癌癥組織中低表達(dá)，并且參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)過程，目前在胃癌、食管癌等細(xì)胞中已經(jīng)得以證實(shí)〔13～15〕。研究表明，miR-26b在肝癌組織中表達(dá)水平降低，并且與患者預(yù)后有關(guān)〔16〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-26b在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平低于正常肝細(xì)胞，提示miR-26b在肝癌中低表達(dá)，這與上述研究報(bào)道結(jié)果類似。

本實(shí)驗(yàn)還在肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miR-26b模擬物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-26b可以抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。正常情況下，細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡中，這也是機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持的重要途徑，當(dāng)細(xì)胞受到致癌因素刺激后，細(xì)胞內(nèi)與凋亡有關(guān)的基因或蛋白表達(dá)水平異常，導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖，凋亡減少，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生癌變，從而形成腫瘤〔17〕。目前研究較多的與細(xì)胞凋亡有關(guān)的兩大家族分別為Caspase和Bcl-2蛋白家族，其中Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)幾乎參與細(xì)胞內(nèi)所有凋亡途徑，Bax是Bcl-2蛋白家族的成員之一，在細(xì)胞凋亡過程中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔18〕。研究顯示，miR-26b介導(dǎo)細(xì)胞凋亡與Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)，與Bax的蛋白表達(dá)有關(guān)〔19〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-26b誘導(dǎo)凋亡執(zhí)行因子Caspase-3活化，促進(jìn)細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)，提示miR-26b誘導(dǎo)Bax、Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

Wnt信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，其在腫瘤組織中的激活水平高于正常的癌旁組織，抑制其激活后可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔20〕。β-catenin是貫穿Wnt信號(hào)通路的中樞蛋白，正常組織中沒有Wnt信號(hào)，β-catenin主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，與鈣黏蛋白結(jié)合共同維持細(xì)胞骨架，少量的β-catenin以復(fù)合物的形式被磷酸化，可以被泛素連接酶等蛋白酶降解，維持細(xì)胞內(nèi)低水平的β-catenin〔21〕。在受到Wnt信號(hào)刺激以后，β-catenin磷酸化受阻，導(dǎo)致β-catenin不能被及時(shí)降解，過量的β-catenin轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)下游靶基因CyclinD1等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)特性的功能〔22〕。研究顯示，miR-26b可以下調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白，miR-26b作用機(jī)制與Wnt信號(hào)通路有關(guān)〔23〕。本實(shí)驗(yàn)表明，miR-26b可以降低肝癌細(xì)胞中β-catenin、CyclinD1蛋白的表達(dá)，抑制Wnt信號(hào)通路的激活，提示miR-26b可能通過抑制Wnt信號(hào)通路的激活誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

miR-26b在腫瘤中低表達(dá)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮類似于抑癌基因的作用，過表達(dá)miR-26b可以抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，下調(diào)Wnt信號(hào)通路的激活水平，對(duì)于其具體的作用機(jī)制還需要在以后實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證。