何澤 成光宇 呂美香 叢婷婷 吳春煒

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 1內(nèi)分泌代謝病科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2實(shí)驗(yàn)中心；長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)3 2014級(jí)中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)科碩士研究生；4 2017級(jí)中醫(yī)內(nèi)科碩士研究生)

足細(xì)胞為腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要組成部分，在維持腎小球?yàn)V過(guò)膜結(jié)構(gòu)和功能上具有重要作用，在糖尿病(DM)及非DM腎小球疾病中，足細(xì)胞數(shù)量減少可直接引起蛋白尿及腎小球硬化，且足細(xì)胞數(shù)量的減少與腎小球硬化程度呈正相關(guān)〔1〕。細(xì)胞凋亡中起主要角色的是Bcl-2家族蛋白和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase)家族蛋白。本文通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)性DM大鼠腎臟中Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白的干預(yù)，觀察解毒通絡(luò)保腎法對(duì)實(shí)驗(yàn)性DM大鼠腎臟足細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料 健康狀況良好的清潔級(jí)Wistar大鼠60只，雌雄各半，體重180～200 g，購(gòu)于吉林省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。給予高糖高脂飼料(主要成分：基礎(chǔ)飼料59%、豬油18%、蔗糖20%、蛋黃3%)，實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由攝食和飲水。

1.2主要試劑和藥品 丹參、黃連、紅參、生地、黃芪、大黃、金蕎麥、枸杞、雙花、地龍(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房)；鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司);枸椽酸、枸椽酸鈉(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)；精蛋白重組人胰島素注射液(通化東寶藥業(yè)股份有限公司)；葡萄糖注射液(河北天成藥業(yè)股份有限公司)。

1.3主要設(shè)備 血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司)，醫(yī)用離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠制造)，電動(dòng)玻璃勻漿器(寧波新芝科研究所)，臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)(Hesmal，德國(guó))，生化自動(dòng)分析儀(日本日立7150型)，全自動(dòng)尿液分析儀(MA-4210，日本)，BSA124S-CW精密電子秤(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(美國(guó)Linco公司)，酶標(biāo)儀(北京康富萊科技)。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的復(fù)制與分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為陰性組(A組,n=10)，其余為造模組。喂養(yǎng)4 w后，造模組進(jìn)行造模，用50 mg/kg STZ(臨用前用0.1 mol/L枸椽酸緩沖液溶解，pH4.3)單次腹腔注射。A組腹腔注射上述等體積檸檬酸緩沖液作為對(duì)照。注射STZ 3 d后檢測(cè)造模組尿糖和血糖，尿糖3+以上，血糖水平≥16.7 mmol/L，尿量和飲水量明顯增多者，列入DM觀察對(duì)象，共49只。將成模DM大鼠，隨機(jī)分為模型組(B組，n=24)、中藥組(C組，n=25)，進(jìn)行灌胃。C組予中藥湯劑解毒通絡(luò)保腎散4.5 g/(kg·d)，1 ml/100 g，每日灌胃1次。A組及B組于每日相同時(shí)間灌胃相同體積無(wú)菌蒸餾水(1 ml/100 g)。

1.5腎臟標(biāo)本及腎組織勻漿制備 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水，每籠飼養(yǎng)5只大鼠，每3 d稱量體重1次，并觀察一般狀態(tài)。分別于第0、4、8 w檢測(cè)各組大鼠空腹血糖(FPG)。8 w末，大鼠單籠收集24 h尿液，檢測(cè)尿量、尿微量白蛋白(mALb)。最后一次給藥后禁食12 h，稱大鼠體重、麻醉，迅速解剖，腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)血清肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)，快速切除雙側(cè)腎臟，濾紙吸干，去掉包膜，用精密天平即刻稱重。取大鼠腎臟，剪取腎組織后稱重，按1:9濃度(W:V=1 g:9 ml)加入勻漿介質(zhì)，電動(dòng)玻璃勻漿器在 4℃條件下制備組織勻漿。3 000 r/min離心10 min，吸取上清液。

1.6Bax、Bcl-2、Caspase-3的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl；樣本孔先加待測(cè)樣本10 μl，再加樣本稀釋液40 μl，空白孔不加；除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μl，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱溫浴60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，重復(fù)洗5次；每孔加入底物A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μl，15 min內(nèi)，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品孔的OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算各樣本濃度。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組血尿生化指標(biāo)比較 B、C組第4、8周FPG、mAlb及Scr和BUN均顯著高于A組(P<0.05，P<0.01)。與B組比較，C組第4、8周FPG、mAlb及Scr和BUN均顯著降低(P<0.01,P<0.05)。見(jiàn)表1、2、3。

2.2各組Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2比較 與A組比較，B、C組Bax、Bax/Bcl-2明顯升高(P<0.01,P<0.05)，Bcl-2明顯降低(P<0.01，P<0.05)；與B組比較，C組Bax、Bax/Bcl-2明顯降低(P<0.01)，Bcl-2明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表4。

2.3各組Caspase-3水平比較 A、B、C組Caspase-3表達(dá)分別為：(44.26±5.09)pmol/L、(61.73±2.45)pmol/L、(54.13±6.25)pmol/L。與A組相比，B、C組Caspase-3表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與B組相比，C組Caspase-3表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

表1 各組0、4、8 w FPG比較

與A組比較:1)P<0.01；與B組比較：2)P<0.01，3)P<0.05，表2、3同

表2 各組Scr、BUN水平比較

表3 各組0、4、8 w mAlb比較

表4 各組腎Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2比較

與A組比較:1)P<0.01，2)P<0.05；與B組比較：3)P<0.01，4)P<0.05

3 討 論

DM高血糖、糖基化終末產(chǎn)物、氧化應(yīng)激等多種因素作用于足細(xì)胞，使其發(fā)生不同形式的損傷，包括細(xì)胞肥大、足突融合、發(fā)育停滯、脫落、凋亡等，導(dǎo)致足細(xì)胞數(shù)目減少、腎小球?yàn)V過(guò)膜完整性破壞而出現(xiàn)蛋白尿。足突融合和消失是足細(xì)胞損傷的最后通路。裂孔隔膜破裂、骨架蛋白改變、腎小球基底膜(GBM)改變或足細(xì)胞附著在GBM上不緊密、足細(xì)胞及足細(xì)胞負(fù)電荷的中和等均可引起足突消失。

裂孔隔膜是血漿蛋白通過(guò)的最后屏障，也是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，與蛋白尿的發(fā)生關(guān)系密切，足突通過(guò)收縮和擴(kuò)張能力，改變裂孔大小和濾過(guò)膜的面積，調(diào)節(jié)大小分子的選擇性濾過(guò)。裂孔隔膜由nephrin、podocin等許多分子組成，其中nephrin 是主要成分之一，是構(gòu)成孔隔膜的分子基礎(chǔ)〔2〕。實(shí)驗(yàn)表明，中藥芪衛(wèi)顆?！?〕低、中、高劑量組與陽(yáng)性組相比，均可上調(diào)裂孔隔膜蛋白nephrin的表達(dá)，減少足細(xì)胞損傷。

足細(xì)胞足突由細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白系統(tǒng)維護(hù)，足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)異常導(dǎo)致足突融合，而足突融合與蛋白尿緊密相關(guān)。α-actinin-4是一種廣泛表達(dá)的肌動(dòng)蛋白交連蛋白，在維持足細(xì)胞正常形態(tài)、黏附、運(yùn)動(dòng)及與β1整合素的磷酸化等生物學(xué)功能上起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)〔4〕，高糖可使足細(xì)胞 α-actinin-4表達(dá)減少，導(dǎo)致足細(xì)胞骨架破壞。榛花消腎安膠囊〔5〕能夠抑制實(shí)驗(yàn)性DM大鼠腎組織α-actinin-4蛋白及mRNA的表達(dá)，改善實(shí)驗(yàn)性 DM 大鼠腎臟組織的病理結(jié)構(gòu)，改善足細(xì)胞狀態(tài)，抑制實(shí)驗(yàn)性DM大鼠早期腎臟肥大，減少mAlb的排出，保護(hù)腎功能。

足細(xì)胞脫落與細(xì)胞基質(zhì)黏附系統(tǒng)破壞密切相關(guān)。整合素是一類細(xì)胞膜上細(xì)胞基質(zhì)黏附受體，結(jié)合GBM中特異性配體來(lái)維持足細(xì)胞的緊密附著。整合素a3β1位于足細(xì)胞足突基底外側(cè)，通過(guò)結(jié)合特異性配體、層黏連蛋白在GBM中被激活。整合素胞質(zhì)區(qū)域結(jié)合多種胞內(nèi)蛋白，這些胞內(nèi)蛋白可以調(diào)節(jié)整合素和足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白系統(tǒng)。足細(xì)胞骨架蛋白-整合素系統(tǒng)失調(diào)將引起足細(xì)胞損傷〔6〕。骨架蛋白重新排列，表面負(fù)電荷減少和整合素表達(dá)減少等都是導(dǎo)致足細(xì)胞脫落的原因〔7〕。Roselli等〔8〕發(fā)現(xiàn)，高糖可抑制DM小鼠足細(xì)胞a3β1整合素的表達(dá)，并隨病程延長(zhǎng)抑制作用加強(qiáng)，故推斷高糖可通過(guò)對(duì)a3β1整合素的抑制作用導(dǎo)致足細(xì)胞脫落及腎小球?yàn)V過(guò)屏障的功能變化。

Podocalyxin是足突頂膜區(qū)一種CD34相關(guān)的帶負(fù)電荷的跨膜蛋白，富含唾液酸和硫酸鹽成分，在足細(xì)胞表面形成多聚糖蛋白復(fù)合物，對(duì)維持足細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和濾過(guò)屏障功能起重要作用。Podocalyxin 表面電荷具有抗黏附作用，其正常表達(dá)能夠抵制相鄰足突間及其與基質(zhì)間的黏附，維持其獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)，防止帶負(fù)電荷的蛋白分子從裂孔隔膜中漏入原尿中。Economou等〔9〕主張?jiān)贒M腎病(DN)可引起Podocalyxin表達(dá)下降，腎小球?yàn)V過(guò)電荷屏障減弱，損傷腎功，加快蛋白尿的出現(xiàn)及DN的進(jìn)展，并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)高糖刺激后Podocalyxin的表達(dá)較陽(yáng)性組下降。朱?；鄣取?0〕發(fā)現(xiàn)清熱益氣通絡(luò)法的自擬中藥湯劑，與陽(yáng)性對(duì)照組比，降低腎重，升高Podocalyxin 蛋白表達(dá)和降低Desmin表達(dá)，從而拮抗足細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化，減輕足細(xì)胞損傷，保護(hù)腎功能，降低Scr清除率、減輕腎臟肥大。細(xì)胞凋亡是受一系列連續(xù)基因調(diào)控的程序化反應(yīng)，在凋亡過(guò)程中，Bcl-2 家族蛋白起重要調(diào)控作用，其作用為雙向的。Bcl-2家族可以分為兩類：一類是抗細(xì)胞凋亡基因，代表基因是Bcl-2基因，另一類是促細(xì)胞凋亡基因，代表基因是Bax基因，它是Bcl-2結(jié)合蛋白，是拮抗Bcl-2的促凋亡因子，與其有同源序列。隨Bcl-2蛋白表達(dá)量上升，越來(lái)越多的Bax二聚體分開(kāi)，與Bcl-2形成比Bax-Bax更穩(wěn)定的Bax-Bcl-2異源二聚體，從而“中和”Bax-Bax誘導(dǎo)凋亡的作用，Bcl-2通過(guò)與Bax結(jié)合抑制凋亡并促進(jìn)細(xì)胞存活〔11〕。Bax與Bcl-2 的比值，決定細(xì)胞最終走向生存還是死亡，若Bax與Bcl-2的比值成上升趨勢(shì)則細(xì)胞走向生存，若Bax與Bcl-2的比值成下降趨勢(shì)，細(xì)胞走向凋亡。他們共同協(xié)調(diào)作用，激活下游基因，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞凋亡有三條途徑，這三條凋亡途徑都是通過(guò)活化Caspase〔12〕，然后作用于底物蛋白,使蛋白分解而引起凋亡。Caspase-3是履行凋亡執(zhí)行功能最主要的蛋白酶之一，位于Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最下游。通常認(rèn)為Caspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，它的活化是凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志。Zehendner等〔13〕發(fā)現(xiàn)在急性腦缺血中，Caspase-3 被迅速激活，緊密連接蛋白的斷裂也隨之啟動(dòng)，實(shí)驗(yàn)肯定了Caspase-3在此過(guò)程中的重要作用。

解毒通絡(luò)保腎散由中藥大黃、黃連、黃芪等10味藥物組成，具有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、解毒通絡(luò)之功效。前期研究表明，中藥復(fù)方解毒通絡(luò)保腎散能夠改善實(shí)驗(yàn)性 DM 大鼠一般狀況，調(diào)節(jié)糖脂代謝，抑制 DM 大鼠腎臟肥大及高濾過(guò)，減少尿蛋白的排出，保護(hù)腎小球結(jié)構(gòu)和功能〔14〕；能夠抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物形成，減少其介導(dǎo)的腎組織損傷〔15〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示解毒通絡(luò)保腎散降低實(shí)驗(yàn)性DM大鼠FPG、Scr、BUN、mAlb，保護(hù)腎功能。本研究提示：腎臟Bax、Bcl-2、Caspase-3在DM大鼠腎臟中的表達(dá)明顯增多，與DM腎臟損害及mAlb的排泄密切相關(guān)，解毒通絡(luò)保腎法下調(diào)DM大鼠腎臟中Bax/Bcl-2的表達(dá)，繼而抑制下游反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白酶Caspase-3產(chǎn)生，而抑制足細(xì)胞凋亡，保護(hù)腎小球?yàn)V過(guò)屏障，延緩病情發(fā)展。