袁曉晨 張昕 孫京京 劉晨 李愛華

(揚州大學附屬醫(yī)院 揚州市第一人民醫(yī)院，江蘇 揚州 225001)

心肌纖維化(MF)是多種心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變，是心肌重構的主要表現之一，這種病理變化在多種心血管疾病中存在，與心律失常、心力衰竭密切相關〔1〕。MF是高血壓左室重構的主要表現之一，表現為細胞外基質合成與降解之間失衡。以往相關藥物干預MF的研究大多集中在抑制心肌膠原的過度增生方面，隨著人們對MF認識的不斷深入，心肌膠原降解酶系及其所導致的心肌膠原降解異常在致MF方面日益顯露其重要作用〔2〕。本研究探討過氧化物酶體增殖物激活型受體(PPAR)γ激動劑吡格列酮對自發(fā)性高血壓大鼠(SHRs)MF的作用及對細胞外基質降解基質金屬蛋白酶(MMP)-1/MMP抑制劑(TIMP)-1的影響，探討其干預高血壓MF的作用機制。

1 材料和方法

1.1動物處理 12月齡雄性SHRs 16只，體重390～420 g；同月齡雄性WKY大鼠8只，體重390～425 g，均購自中國科學院上海實驗動物中心。SHRs隨機分為吡格列酮組和SHR組，每組8只。吡格列酮組：吡格列酮(10 mg/kg，中美華東制藥公司)灌胃給藥，SHR組及WKY鼠(對照組)僅灌生理鹽水，每日1次，給藥8 w后麻醉大鼠，開胸取心臟，以預冷的生理鹽水洗脫去血液，濾紙吸干水分，電子天平準確測量左心室重量，并計算左室重量指數(LVI)。取部分心肌組織10%甲醛溶液固定12 h后常規(guī)石蠟包埋，部分組織-80℃保存用于羥脯氨酸濃度測定，部分組織迅速液氮保存用于實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)和Western印跡檢測。

1.2收縮壓(SBP)的測定 治療前后各測血壓1次，用RBP-1型大鼠尾動脈血壓心率測定儀(中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所研制)測量3次取均值。

1.3大鼠心肌組織膠原定性和定量分析 取左室中段橫截面心肌組織，常規(guī)固定、包埋和制片，進行HE染色和Masson染色。在Masson染色下心肌細胞呈紅色，膠原呈綠色。采用CISA-1000計算機圖像分析系統進行分析，測量心肌膠原容積分數(CVF)和血管周圍膠原面積(PVCA)。CVF=膠原面積/總面積，其中膠原面積不包括血管周圍膠原面積，PVCA=壁內小動脈管腔周圍膠原面積/動脈管腔面積，標本均隨機取3～5個視野測量，取其均值。

1.4羥脯氨酸濃度測定 按試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明將100 mg組織剪碎后加堿水解液煮沸消化，調pH值至6.0～6.8，離心后取上清液用分光光度計測吸光度，通過公式計算出羥脯氨酸濃度。

1.5Western印跡法檢測大鼠左心室心肌組織MMP-1和TIMP-1蛋白表達 用液氮保存的心室組織剪碎提取心肌組織總蛋白。二辛可寧酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(上海申能博彩生物科技有限公司)定量后，取50 μg總蛋白上樣，室溫下十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。完畢后4℃、100 V電泳轉膜。轉膜結束后，硝酸纖維素膜于50 ml/L的脫脂牛奶封閉液中室溫下封閉1 h后與一抗(小鼠抗大鼠MMP-1單克隆抗體，稀釋濃度為1∶1 000；兔抗鼠TIMP-1多克隆抗體，稀釋濃度為1∶500，美國Santa Cruz公司)4℃孵育過夜，與1∶5 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，再與化學發(fā)光試劑溫浴3 min后曝光、顯影和定影，最后對結果進行光密度掃描分析，設actin為內對照，被測蛋白與內對照所測灰度值的比值(相對灰度值)代表蛋白的相對表達量。

1.6心肌組織超氧化物歧化酶(SOD)和活性氧(ROS)測定 稱取冰凍心肌組織100 mg，加預冷的勻漿介質于燒杯中，勻漿器冰上勻漿，3 000 r/min低溫離心10～15 min，分離提取上清液，制備成10%組織勻漿，稀釋9倍制備成1%組織勻漿，按SOD和ROS測定試劑盒說明書操作步驟分別測定其活性。

1.7qRT-PCR檢測PPARγ mRNA水平 采用Trizol法提取細胞總RNA，測定RNA濃度及純度。使用TAKARA逆轉錄試劑盒反轉錄為cDNA。使用TAKARA PCR試劑盒，采用嵌合熒光檢測法進行qRT-PCR(避光，冰上配制)，反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 個循環(huán)。以 β-actin mRNA為內參，采用下列公式定量分析：目的基因表達量=2-△△ct。β-actin上游引物：TATGACTTAGTTGCGTTACACC，下游引物：CCTTCACCGTTCCAGTTT；PPARγ上游引物：TCCGTGATGGAAGACCACTC，下游引物：CCCTTGCATCCTTCACAAGC。

1.8免疫組織化學法檢測PPARγ的表達 采用抗生物素-生物素-過氧化物酶復合物(ABC)法，按說明書操作(試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色。結果判定在心肌細胞、血管壁細胞膜和胞質內出現棕褐色顆粒，且著色強度高于背景的特殊染色者判為陽性。采用CISA-1000計算機圖像分析系統分析計算免疫組化染色面積。

1.9統計學分析 采用SPSS8.0軟件進行方差分析或秩和檢驗。

2 結 果

2.1各組SBP、LVI、CVF、PVCA和羥脯氨酸濃度 吡格列酮組SBP較SHR組明顯降低，但未降到對照組水平，吡格列酮組LVI、CVF、PVCA、羥脯氨酸水平明顯低于SHR組。與對照組比較，SHR組各指標均有顯著差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組SBP、LVI、CVF、PVCA和羥脯氨酸水平比較

與對照組比較：1)P<0.05；與SHR組比較：2)P<0.05

2.2各組MF變化 HE染色顯示：對照組心肌纖維排列整齊。SHR組心肌細胞肥大、心肌纖維排列疏松紊亂，甚至斷裂，細胞核大小不規(guī)則，并可見炎細胞浸潤。吡格列酮組心肌細胞肥大改善、心肌細胞排列較為整齊，胞內心肌纖維斷裂情況明顯好轉。見圖1。Masson染色可見心肌細胞染色呈紅色，間質膠原呈綠色。對照組膠原組織分布稀疏，相鄰細胞的膠原纖維網完好，著色淡，心肌間質及血管周圍僅見少量膠原纖維；SHR組心肌內膠原組織明顯增多，圍繞心肌細胞的膠原纖維網斷裂、排列紊亂，心肌間質及血管周圍膠原纖維明顯增生；吡格列酮組膠原纖維較SHR組明顯減少，排列較規(guī)整。與對照組比較，SHR組及吡格列酮組心內膜、心外膜和小動脈周圍的膠原含量明顯增多，表明SHR心肌膠原含量增多，心肌間質發(fā)生明顯纖維化；而吡格列酮組與SHR組相比心室內、外膜及心肌小動脈周圍的膠原減少，表明吡格列酮對SHR治療可減輕心肌膠原的堆積，有改善MF作用。見圖2。

圖1 各組MF變化(HE，×200)

2.3心肌組織中MMP-1、TIMP-1蛋白表達 Western印跡檢測發(fā)現SHR組心肌組織MMP-1蛋白表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，吡格列酮組MMP-1表達上調(P<0.05)。TIMP-1在SHR組心肌組織表達明顯增高，吡格列酮組表達顯著降低(P<0.05)，MMP-1/TIMP-1在SHR組較對照組降低，提示膠原在代謝中降解不足，使心肌間質膠原纖維含量增加，而發(fā)生過度沉積，吡格列酮組MMP-1/TIMP-1明顯增高(P<0.05)。見圖3和表2。

圖2 各組MF變化(Masson膠原染色，×200)

圖3 各組心肌組織MMP-1、TIMP-1蛋白Western印跡結果

組別MMP-1TIMP-1MMP-1/TIMP-1對照組0.52±0.150.61±0.090.85±0.12SHR組2.67±0.481)4.18±0.571)0.63±0.171)吡格列酮組3.75±0.591)2)1.85±0.651)2)2.03±0.341)2)

2.4各組心肌組織PPARγ和mRNA表達 與對照組(1.00±0.16)比較，SHR組左室心肌組織PPARγ mRNA表達(0.41±0.08)顯著減少(P<0.05)；吡格列酮組PPARγ mRNA表達(0.81±0.14)較SHR組顯著升高(P<0.05)。心肌組織PPARγ的表達量3組沒有統計學差異(P>0.05)；與對照組(6.37±0.78)相比，SHR組PPARγ的表達量(2.80±0.18)在血管中顯著下降(P<0.05)，吡格列酮能顯著增加血管中PPARγ表達(4.95±0.36)(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組心肌組織和血管組織PPARγ表達(免疫組織化學，×200)

2.5各組心肌組織氧化、抗氧化能力的變化及吡格列酮對其影響 SHR組與對照組ROS和SOD 均存在顯著差異(P<0.05)，表明SHR心肌組織存在病理性氧化應激。治療8 w后吡格列酮組與SHR組相比，心肌SOD 濃度雖無明顯升高，但ROS 濃度顯著下降(P<0.05)，表明吡格列酮具有抗氧化作用。見表3。

表3 各組心肌ROS和SOD濃度變化

3 討 論

高血壓引起長期的心臟后負荷加重，使心臟正常結構改變，心肌間質纖維化及膠原蛋白過量堆積破壞了心臟結構平衡，從而容易導致各種心血管事件的發(fā)生。高血壓MF形成的病理機制是復雜的，但最終可歸結為心肌膠原的合成大于降解的結果。已往藥物研究較多地關注了抑制心肌膠原的過度合成，對心肌膠原降解異常方面的研究甚少，在心肌中存在的能降解所有心臟基質成分的MMPs，是心臟基質降解的主要因素，其濃度活性受TIMPs抑制。在膠原降解過程中，MMP-1作為一種膠原酶，是MMPs家族中最為特殊的一種酶，同時也是啟動膠原降解的唯一酶，其抑制物TIMP-1是一種糖蛋白，它可與活化的MMP-1、3、9形成1∶1的復合物而抑制其活性，降低細胞外基質的降解。MMPs/TIMPs比例失調是導致MF的重要因素，MMPs/TIMPs在MF發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用〔3〕。PPARγ是核受體PPARs的一個亞家族，在心臟中表達豐富，參與脂肪生成和葡萄糖代謝。胰島素增敏劑噻唑烷二酮類是PPARγ的合成配體。最近，噻唑烷二酮類的非降糖作用已經成為新的研究熱點，主要集中于其心血管保護作用，如抑制血管平滑肌細胞增殖、改善血脂代謝、改善內皮功能、降低纖溶酶原激活抑制物-1和減少動脈粥樣硬化發(fā)生等〔4〕。Sakai等〔5〕發(fā)現吡格列酮通過抑制激活蛋白(AP)-1誘導內皮素(ET)-1基因上調，抑制心肌細胞肥大，從而抑制心肌肥厚。PPARγ激動劑可使人單核細胞源性巨噬細胞或人單核/巨噬細胞株上調PPARγ表達，抑制MMPs等表達，調節(jié)MMPs/TIMPs平衡。心力衰竭及糖尿病高半胱氨酸血癥可激活MMP-9，與PPARγ mRNA表達呈負相關〔6〕，提示PPARγ配體可能抑制MMP-9表達，維持膠原纖維網功能。

本實驗表明，吡格列酮對SHR有明顯的降壓及抑制MF作用，可使SHR的SBP、LVI、PVCA、CVF明顯降低。吡格列酮能促進SHR心肌間質膠原的降解，不但能顯著升高心肌MMP-1水平，而且能降低心肌TIMP-1水平，MMP-1/TIMP-1升高，心肌間質膠原增生等病理變化較SHR明顯減輕。吡格列酮可通過改善MMPs/TIMPs平衡，減少心肌間質異常重構，減輕SHR發(fā)生、發(fā)展，為高血壓MF防治和研究提供新的思路。但吡格列酮通過何種信號途徑介導MMPs/TIMPs平衡，有待研究。體內和體外研究提供證據顯示吡格列酮作為PPARγ配體可能通過調節(jié)炎性細胞因子基因轉錄的信號轉導途徑抑制組織炎癥，對心血管具有重要的保護作用〔7〕。本研究結果提示吡格列酮可以通過上調PPARγ的表達，增強其轉錄活性，發(fā)揮其逆轉心肌間質重構的作用。

近年來，氧化應激在心血管疾病發(fā)生和發(fā)展過程中的作用日益受到重視。Tsujimoto等〔8〕研究發(fā)現壓力過負荷誘導的心肌肥大伴隨著顯著上調的ROS水平，應用自由基清除劑可明顯抑制心肌肥大反應。研究表明，慢性壓力超負荷能夠促進體內ROS (如ONOO-和H2O2)的生物合成，ONOO-可以激活定位于心肌細胞粗、細肌絲上的MMP-2活性，同時影響TIMP-2的翻譯后修飾過程使TIMP-2失活，導致MMPs/TIMPs平衡失調，顯示慢性壓力超負荷介導的氧化應激損傷與心臟中MMPs/TIMPs失衡有關〔9，10〕。本實驗提示PPARγ激動劑對心肌線粒體脂質過氧化有較好的拮抗作用，可減輕氧自由基介導的線粒體膜結構與功能的損傷，從而減輕高血壓過程中脂質過氧化和自由基對SHR心肌線粒體的損傷，來減輕MF。吡格列酮通過激活PPARγ，抑制SHR心肌的過氧化損傷，可能進而抑制氧化還原敏感的核轉錄因子(NF)-κB和AP-1及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信號轉導途徑，通過信號轉導途徑調控MMPs和TIMPs的表達，使得MMPs與TIMPs的平衡破壞得到改善，膠原表達減少，減輕細胞外基質重構。