彭暉 閭宏偉

(1中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗中心，湖南 長沙 410000；2長沙縣星沙醫(yī)院)

在糖尿病的并發(fā)癥中，大血管和微血管病變是其主要并發(fā)癥，具有發(fā)生率高、致殘和致死率高等特點〔1〕,目前公認血管內(nèi)皮功能障礙是糖尿病血管病變發(fā)生的始動因素和主要病理生理學(xué)基礎(chǔ)〔2〕。1-磷酸鞘氨醇(S1P)是鞘磷脂代謝的中間產(chǎn)物，同時也是一種重要的信號分子，S1P與靶細胞表面的特異性受體——1-磷酸鞘氨醇受體(S1PR)結(jié)合，通過結(jié)合不同的G 蛋白,進一步激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，包括細胞的增殖、凋亡、遷移、血管生成等〔3,4〕。在本實驗課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)高糖處理的內(nèi)皮細胞S1PR2表達增加，活性氧(ROS)生成增加，一氧化氮(NO)生成減少，內(nèi)皮細胞體外血管形成能力明顯減弱,通過下調(diào)S1PR2的表達，內(nèi)皮細胞體外血管形成能力和NO生成明顯得以改善〔5〕，表明S1PR2與高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞功能紊亂相關(guān)，但S1PR2介導(dǎo)高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞功能障礙的具體下游通路仍不清楚。本研究擬通過使用S1PR2特異性拮抗劑(JTE-013)下調(diào)S1PR2表達后，檢測高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞的增殖，進一步探討在高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞中S1PR2的作用通路。

1 材料與方法

1.1材料 人脈靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)購自中國科學(xué)院細胞庫；DMEM低糖培養(yǎng)基購自Gibco公司,胎牛血清購自BD公司，p-GSK-3β兔單克隆抗體、GSK-3β兔單克隆抗體、AKT兔單克隆抗體、p-AKT兔單克隆抗體、β-catenin兔單克隆抗體、cyclin D1兔單克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司，S1PR2兔單克隆抗體、GAPDH 兔單克隆抗體購自Protein Tech公司，IRDye 800CW 羊抗兔紅外染料購于美國LI-COR公司，JTE-013購于Cayman公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)。

1.2實驗方法

1.2.1HUVECs 培養(yǎng) 在含10%胎牛血清、1%青霉素+1%鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基中HUVECs呈貼壁生長，放置于37℃，5%CO2培育箱中培養(yǎng)至80%融合狀態(tài)時，用0.25%的胰蛋白消化細胞并傳代,第4～10代細胞用于實驗。高糖培養(yǎng)內(nèi)皮細胞:正常培養(yǎng)內(nèi)皮細胞接近匯合狀，用無血清培養(yǎng)基同步化處理12 h后更換成含30 mmol/L高糖的培養(yǎng)基，即正常糖培養(yǎng)基(含5.5 mmol/L葡萄糖) 中加入24.5 mmol/L葡萄糖至終濃度為30 mmol/L為高糖培養(yǎng)。24.5 mmol/L甘露醇作為高滲對照，實驗分組為：正常組、甘露醇組、高糖組、高糖+JTE-013組(1 μmol/L，JTE-013組)。

1.2.2CCK-8檢測細胞存活率 將消化后的細胞制成細胞懸液，接種于96孔板中，每個孔總體積為100 μl，每個孔的細胞總數(shù)為5×103個，置于恒溫CO2箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，細胞分組并進行相應(yīng)的干預(yù)，每個組各設(shè)5個復(fù)孔。周圍的孔用磷酸鹽緩沖液(PBS)填充。干預(yù)合適的時間后，向每孔加入10 μl的CCK-8溶液(注意不要使孔中產(chǎn)生氣泡)，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光值。

1.2.3Western印跡檢測p-GSK-3β、GSK-3β、AKT、p-AKT、β-catenin、cyclin D1、S1PR2、GAPDH蛋白表達 用新鮮配置的細胞裂解液裂解內(nèi)皮細胞，收集細胞裂解液移至1.5 ml EP 管中，采用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒測定各組細胞裂解液中蛋白質(zhì)含量。準備好每孔蛋白樣品30 μg，進行電泳分析，十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離膠選用濃度為10%，濃縮膠濃度為 5%，在Bio-Rad 電轉(zhuǎn)儀上轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗稀釋液按下列比例稀釋一抗〔S1PR2 抗體:1∶500，p-GSK-3β(ser9)抗體1∶1 000，GSK-3β抗體：1∶1 000,AKT抗體：1∶1 000，p-AKT(ser473)抗體：1∶1 000，β-catenin抗體：1∶1 000，cyclin D1抗體：1∶1 000，GAPDH抗體：1∶3 000〕,4℃孵育過夜，次日，IRDye 800CW 羊抗兔紅外染料(染料：二抗稀釋液=1∶10 000)室溫避光孵育1 h，TBST清洗3次后，將PVDF膜直接放于Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)顯影。 顯影結(jié)果經(jīng)Image J 軟件進行灰度分析，計算每個蛋白條帶光度與相應(yīng)內(nèi)參的光度比值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進行單因素分析、獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1高糖對內(nèi)皮細胞S1PR2表達的影響 30 mmol/L高糖干預(yù)72 h后，內(nèi)皮細胞S1PR2表達增加(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 高糖對S1PR2、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β、β-catenin、cyclin D1蛋白的影響

與正常組比較：1)P<0.05

圖1 高糖對內(nèi)皮細胞S1PR2表達的影響

2.2S1PR2拮抗劑(JTE-013)對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞存活率的影響 與正常組內(nèi)皮細胞存活率〔(100.00±0.00%)〕比較，高糖引起內(nèi)皮細胞存活率明顯降低〔(73.65±2.68)%，P<0.05〕；予JTE-013刺激后，高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞存活率〔(87.20±4.72)%〕較高糖組明顯增加(P<0.05)。甘露醇組〔(96.05±3.79)%〕與正常組相比無明顯改變(P>0.05)。

2.3高糖對AKT/GSK-3β通路的影響 如表1，圖2，3，高糖組內(nèi)皮細胞AKT和GSK-3β磷酸化蛋白水平均明顯減少,β-catenin、cyclin D1蛋白表達明顯減少(P<0.05)。甘露醇組與正常組相比無明顯改變(P>0.05)。

2.4下調(diào)S1PR2對AKT/GSK-3β通路的影響 如

表2，圖4，5所示，JTE-013刺激后高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞AKT和GSK-3β磷酸化蛋白水平顯著增加，β-catenin、cyclin D1蛋白表達顯著增加(P<0.05)。

圖2 高糖對內(nèi)皮細胞AKT/GSK-3β信號通路的影響

圖3 高糖對內(nèi)皮細胞β-catenin、cyclin D1蛋白的影響

組別p-AKT/AKTp-GSK-3β/ GSK-3ββ-catenincyclin D1高糖組0.40±0.180.23±0.060.27±0.050.19±0.05JTE-013組0.81±0.111)0.61±0.131)0.48±0.051)0.43±0.041)

與高糖組比較：1)P<0.05

圖4 JTE-013對高糖干預(yù)下內(nèi)皮細胞AKT/GSK-3β通路的影響

圖5 JTE-013對高糖干預(yù)下內(nèi)皮細胞β-catenin、cyclin D1蛋白的影響

3 討 論

糖尿病是一種常見的慢性代謝性疾病，嚴重威脅人類健康。同時，心血管疾病是糖尿病最重要的并發(fā)癥及死因，而糖尿病血管病變具有發(fā)生率高、致殘和致死率高等特點。血管內(nèi)皮功能障礙是糖尿病血管病變的始動因素。高血糖引起內(nèi)皮一系列分子水平的變化，如線粒體功能障礙，氧化應(yīng)激水平增加，內(nèi)皮細胞的凋亡增加〔6,7〕，血管擴張劑與血管收縮劑前列腺素的產(chǎn)生失衡，這些改變均可加速內(nèi)皮功能障礙的進程〔8〕。在本研究中證實高糖抑制內(nèi)皮細胞的存活。

S1P是一種重要的信號分子，血漿中的S1P主要以結(jié)合形式存在，高密度脂蛋白(HDL)和白蛋白是其主要載體。S1P與糖尿病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有研究顯示2型糖尿病患者血清S1P水平明顯高于健康人群〔9,10〕。S1P與通過與靶細胞表面S1PR結(jié)合，激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，在內(nèi)皮細胞中，內(nèi)皮細胞表面主要存在S1PR1、S1PR2和S1PR3三種受體的表達,S1P作用于S1PR2,通過激活Rho/ROCK/PTEN信號通路,抑制Rac蛋白活性,抑制內(nèi)皮細胞遷移，破壞黏著連接點，同時引起細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，促進血管通透性增加，破壞內(nèi)皮屏障〔11〕。本文用高糖干預(yù)臍靜脈內(nèi)皮細胞，S1PR2表達增加，下調(diào)S1PR2后在內(nèi)皮細胞存活率增加，說明S1PR2參與了高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞的增殖減少。下調(diào)S1PR2表達后,高糖干預(yù)后的內(nèi)皮細胞的存活率增加。同時發(fā)現(xiàn)AKT/GSK-3β/β-catenin/cyclin D1通路中的蛋白均有表達變化，p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin、cyclin D1蛋白表達均增加。

AKT作為細胞內(nèi)的關(guān)鍵信號分子之一，在細胞增殖、遷移、分化、凋亡和物質(zhì)代謝等一系列生理和病理進程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用〔12〕,在高糖作用下，S1PR2通過PI3K/AKT/eNOS通路減少NO的生成，引起內(nèi)皮舒張功能障礙〔13〕。Akt能磷酸化GSK-3β,拮抗β-catenin的降解，使其濃度升高，通過下調(diào)E-鈣黏素表達，降低細胞的黏附能力〔14〕，在心肌細胞中Akt通過激活GSK-3β/β-catenin信號通路保護高脂誘導(dǎo)的細胞凋亡〔15〕。

在S1P與GSK-3β的研究中，既往發(fā)現(xiàn)S1P類似物FTY720能通過抑制GSK-3β，調(diào)節(jié)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，保護糖尿病心臟缺血再灌注損傷〔16〕。S1P通常結(jié)合于靶細胞表面的S1P受體激活細胞內(nèi)信號通路，在該實驗中尚未進一步研究FTY720抑制GSK-3β表達的具體作用S1PR。在本實驗中首次發(fā)現(xiàn)，在臍靜脈內(nèi)皮細胞中，S1PR2通過激活下游GSK-3β參與高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙。

GSK-3β、β-catenin為Wnt經(jīng)典信號通路中的重要蛋白分子，廣泛存在于各種類型的細胞,如內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、成骨細胞中，調(diào)控細胞生長、分化和凋亡等〔17〕，如在高糖高脂干預(yù)的主動脈內(nèi)皮細胞中，細胞GSK-3β表達增加，抑制GSK-3β能增加基礎(chǔ)自噬及激活A(yù)MPK信號，改善內(nèi)皮功能〔18〕；在高糖刺激下，Wnt/β-catenin信號通路可以調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細胞和腎小球系膜細胞的存活和增殖,促進血管新生，提高β-catenin及p-GSK-3β(Ser9)的表達，抑制GSK-3β的表達，能降低高糖引起的細胞凋亡〔19,20〕。在本實驗中，高糖干預(yù)下β-catenin表達減少,拮抗S1PR2后β-catenin表達增加,考慮JTE-013通過激活A(yù)KT/GSK-3β/β-catenin通路，促進高糖干預(yù)的內(nèi)皮細胞的增殖。

cyclin D1是Wnt/β-catenin信號通路下游的一個靶基因〔21〕，cyclin D1是細胞由G1 期向S期轉(zhuǎn)換的重要限速因素，其表達可以直接影響到細胞的增殖〔22,23〕。在本實驗中發(fā)現(xiàn)高糖干預(yù)下，cyclin D1表達降低，下調(diào)S1PR2能引起cyclin D1的表達增加。因此，綜上所述，S1PR2可能通過AKT/GSK-3β/β-catenin/cyclin D1，影響內(nèi)皮細胞增殖。

簡言之，本研究結(jié)果顯示S1PR2參與高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞增殖降低，下調(diào)S1PR2后上述內(nèi)皮細胞功能得以明顯改善，激活A(yù)KT/GSK-3β/β-catenin/cyclin D1信號通路可能是S1PR2 抑制劑改善高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷的作用機制之一。