姚金曉 楊如玉 馬海龍 李超 魏旭東

(1南陽(yáng)市中心醫(yī)院血液內(nèi)科，河南 南陽(yáng) 473000；2鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院血液科)

急性髓性白血病(AML)是一種克隆性造血干細(xì)胞惡性疾病，由多能干細(xì)胞或白血病母細(xì)胞突變形成，可導(dǎo)致未成熟髓細(xì)胞的異常蓄積和骨髓造血功能的抑制〔1,2〕。目前臨床中對(duì)AML的治療常采用聯(lián)合序貫化療的方法，盡管在一定程度上緩解了患者的發(fā)病進(jìn)程，但患者長(zhǎng)期無(wú)病生存率(OS)僅為25%～30%〔3，4〕。微小RNA(miRNA)是一類含18～25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的非蛋白編碼RNA，可通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)域(3'UTR)互補(bǔ)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致靶mRNA的抑制或降解〔5,6〕，并參與靶基因調(diào)控的多種生理和病理過(guò)程，如細(xì)胞增殖、分化、器官形成、胚胎發(fā)生和凋亡等〔7〕。此外，異常表達(dá)的miRNA還可調(diào)節(jié)包括AML在內(nèi)的多種癌癥發(fā)生過(guò)程。miR-143作為一種重要的抑癌因子在多種惡性腫瘤中均表現(xiàn)出明顯的低表達(dá)，如結(jié)腸直腸癌〔8〕、骨肉瘤〔9〕、乳腺癌〔10〕等，但miR-143在AML發(fā)生中的功能和調(diào)控機(jī)制還有待深入研究。本研究通過(guò)分析miR-143在AML患者外周血及相關(guān)細(xì)胞中的表達(dá)和功能深入探究miR-143調(diào)控AML發(fā)生的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 AML患者和健康人外周血各30份，樣品均來(lái)源于南陽(yáng)市中心醫(yī)院；人胚胎腎細(xì)胞293T、人髓性白血病細(xì)胞HL60購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；人骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5、人髓性白血病細(xì)胞K562購(gòu)自美國(guó)ATCC。胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；Lipofectmine 2000 (美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)、2×Maxima SYBR Green qRT-PCR Master Mix、miRNA逆轉(zhuǎn)錄測(cè)試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、psiCHECKTM-2(美國(guó)Promega公司)；點(diǎn)突變?cè)噭┖?日本Takara)；Transwell細(xì)胞小室、基質(zhì)膠(北京索萊寶科技有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒、電化學(xué)發(fā)光液(ECL)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；己糖激酶(HK)2、β-actin抗體、小鼠抗人二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.2方法

1.2.1樣品收集 于2015年10月至2017年5月采用靜脈采血法收集AML患者和健康人外周血(正常對(duì)照組)，將采血管垂直放置2 h后，放入離心機(jī)中，3000 r/min離心10 min，將上層清液(血漿)轉(zhuǎn)移到新的樣品管中后，采用qRT-PCR法測(cè)定血漿中miR-143的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南陽(yáng)市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)miRNA和mRNA表達(dá) 采用TRIzol法提取血漿和細(xì)胞中的總RNA，分別利用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；利用2×Maxima SYBR Green qRT-PCR Master Mix在熒光定量PCR儀上測(cè)定miR-143和HK2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)和U6作為內(nèi)源性對(duì)照。HK2引物：正義鏈:5'-TCT GTA ATG GTG TGC TTC AAG G-3'和反義鏈:5'-GTG TCC AGC ATV CAG AAA GG-3'。GAPDH引物：正義鏈:5'-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3' 和反義鏈:5'-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3'。miR-143及U6引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)和傳代 293T、HS-5、HL60、K562細(xì)胞均培養(yǎng)在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，并置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，加入0.25%的胰蛋白酶消化，之后更換培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-143 mimics、miR-143抑制劑及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。將細(xì)胞培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，接種于24孔板中，利用Lipofectmine2000將上述寡核苷酸轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，分別記為miR-143 mimics組、miR-143抑制劑組、miR-NC組、anti-miR-NC組，轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)各指標(biāo)的變化。

1.2.5Transwell小室法測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 將miR-143 mimics和miR-NC轉(zhuǎn)染到HL60細(xì)胞中，分別記為miR-143 mimics組和miR-NC組，48 h后用胰酶消化后，用不含血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞密度調(diào)整為5×105/ml。向上室內(nèi)加入100 μl的細(xì)胞懸液，下室內(nèi)加入500 μl的完全培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，甲醇固定10 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，倒置顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照，隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算10個(gè)視野的平均細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)需要在小室內(nèi)膜鋪上基質(zhì)膠以模仿細(xì)胞外基質(zhì)。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告分析 擴(kuò)增HK2基因片段中含miR-143結(jié)合位點(diǎn)的序列，之后將擴(kuò)增的序列克隆到psiCHECKTM-2報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建野生型HK2(HK-WT)報(bào)告質(zhì)粒。使用點(diǎn)突變?cè)噭┖?日本Takara)對(duì)HK-WT質(zhì)粒上的miR-143結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建突變型HK2(HK2-MUT)報(bào)告載體。將HK-WT或HK2-MUT與miR-143 mimics、miR-NC、miR-143抑制劑或anti-miR-143共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，分別記為miR-143 mimics組、miR-NC組、miR-143抑制劑組及anti-miR-NC組，48 h后利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性。

1.2.7Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞加入RIPA裂解液裂解，離心分離上清，利用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)蛋白含量。取上述蛋白與上樣緩沖液混勻煮沸5 min使蛋白變性，十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，脫脂奶粉封閉后加入HK2抗體孵育，之后再加入二抗孵育，利用ECL對(duì)蛋白進(jìn)行發(fā)光顯色，β-actin作為內(nèi)源對(duì)照，采用Image J軟件對(duì)蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.3主要觀察指標(biāo) miR-143在AML患者血漿和細(xì)胞中的表達(dá)；過(guò)表達(dá)miR-143對(duì)HL60細(xì)胞遷移和侵襲的影響；miR-143和HK2在HL60細(xì)胞中的靶向關(guān)系分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-143在AML患者血漿及相應(yīng)細(xì)胞系中的表達(dá) AML患者血漿中的miR-143水平(0.36±0.13)顯著低于正常對(duì)照組(1.23±0.26，P<0.05；n=3)。AML細(xì)胞系HL60(0.24±0.02)和K562(0.41±0.03)中miR-143表達(dá)水平也顯著低于正常細(xì)胞HS-5(1.00±0.09；P<0.01,P<0.05;n=3)，其中HL60細(xì)胞中miR-143水平降低最明顯，因此，選用HL60細(xì)胞做后續(xù)功能和機(jī)制研究。

2.2miR-143轉(zhuǎn)染效率分析 miR-143 mimics組miR-143表達(dá)水平(4.53±0.42)顯著高于miR-NC組〔(1.03±0.08)，P<0.05；n=3〕。由此說(shuō)明通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-143 mimics可成功構(gòu)建miR-143過(guò)表達(dá)模型。

2.3miR-143過(guò)表達(dá)對(duì)AML細(xì)胞遷移和侵襲的影響 miR-143 mimics組細(xì)胞遷移能力〔(40±6)個(gè)〕明顯低于miR-NC組〔(112±10)個(gè)，P<0.05；n=3〕；miR-143 mimics組細(xì)胞侵襲能力〔(39±4)個(gè)〕也明顯低于miR-NC組〔(105±9)個(gè)，P<0.05；n=3〕。上述結(jié)果表明，miR-143過(guò)表達(dá)可抑制AML細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

2.4miR-143與HK2靶向關(guān)系驗(yàn)證 利用Targetscan軟件對(duì)miR-143的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖1所示，HK2是miR-18a的一個(gè)候選靶基因。與miR-NC組(1.06±0.07)相比，miR-143 mimics組明顯抑制HK2-WT的熒光素酶活性〔(0.35±0.04)，P<0.05；n=3〕，但對(duì)HK2-MUT熒光素酶活性無(wú)影響〔(1.01±0.05)vs(0.89±0.11)，P>0.05；n=3〕；與anti-miR-NC組(0.96±0.04)相比，miR-143抑制劑組顯著促進(jìn)HK2-WT的熒光素酶活性〔(2.96±0.24)，P<0.05；n=3〕，但對(duì)HK2-MUT熒光素酶活性無(wú)影響〔(1.04±0.02)個(gè)vs(1.29±0.09)個(gè)，P>0.05;n=3〕。由此得知，miR-143能夠與HK2靶向結(jié)合。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-143與HK2的靶向關(guān)系驗(yàn)證

2.5HK2在AML中的表達(dá)及miR-143對(duì)HK2蛋白表達(dá)的調(diào)控 AML患者血漿中的HK2水平(3.21±0.34)顯著高于正常對(duì)照組〔(1.09±0.11)，P<0.05；n=3〕；AML細(xì)胞系HL60(3.95±0.29)和K562(1.89±0.17)中miR-143表達(dá)水平顯著高于正常細(xì)胞HS-5〔1.00±0.07)；P<0.01，P<0.05；n=3〕。與miR-NC組(1.05±0.05)相比，miR-143 mimics組顯著抑制HK2蛋白表達(dá)〔(0.33±0.03)，P<0.05；n=3〕；與anti-miR-NC組(0.97±0.03)相比，miR-143抑制劑組明顯促進(jìn)HK2表達(dá)〔(2.67±0.24)，P<0.05；n=3〕。以上結(jié)果證明，HK2在AML中高表達(dá)，且miR-143可負(fù)調(diào)控HK2蛋白表達(dá)。見(jiàn)圖2。

1～4:miR-NC組、miR-143 mimic組、anti-miR-NC組、miR-143抑制劑組圖2 各組HK2蛋白表達(dá)

3 討 論

從分子角度看，癌癥是由于腫瘤抑制因子和致癌基因的異常表達(dá)而導(dǎo)致的疾病，多種基因的表觀遺傳變化均可導(dǎo)致正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。研究證實(shí)，在AML的發(fā)生中，F(xiàn)LT3、C-KIT、NPM1等基因的突變均可作為該病的獨(dú)立診斷、預(yù)后和治療因子〔11,12〕，但在實(shí)際檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，AML基因突變的頻率相對(duì)較低，對(duì)于未發(fā)生細(xì)胞遺傳學(xué)改變的患者，其生存率和預(yù)后仍是AML臨床治療中的一大難題。因此，有必要尋找一種更有價(jià)值的生物標(biāo)記物以提高我們對(duì)AML生物學(xué)特性的理解，進(jìn)而為AML臨床治療策略的優(yōu)化提供理論支持。隨著基因芯片和高通量測(cè)序技術(shù)的不斷成熟，人們逐漸發(fā)現(xiàn)除了蛋白質(zhì)編碼基因外，越來(lái)越多的非編碼RNA被證實(shí)可參與疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。研究表明miRNA可通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)在包括AML在內(nèi)的多種腫瘤中發(fā)揮抑癌或促腫瘤形成作用。如在AML患者骨髓細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平明顯升高，且上調(diào)的miR-21與腫瘤負(fù)荷及患者預(yù)后密切相關(guān)〔13〕；相反的，miR-125b可通過(guò)失活核因子(NF)-κB信號(hào)通路抑制AML細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，最終緩解AML發(fā)展進(jìn)程〔14〕。

miR-143最初在鼠組織中被發(fā)現(xiàn)，具有明顯的組織特異性。研究表明，miR-143在多種惡性腫瘤中均出現(xiàn)明顯的低表達(dá)，功能試驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)miR-143可通過(guò)抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、遷移和侵襲等生理過(guò)程發(fā)揮抑癌作用。Clape等〔15〕通過(guò)裸鼠成瘤試驗(yàn)證實(shí)，miR-143表達(dá)水平與前列腺癌晚期病理分期呈明顯負(fù)相關(guān)，通過(guò)外源過(guò)表達(dá)miR-143可導(dǎo)致細(xì)胞增殖停滯，并抑制小鼠腫瘤形成；Yan等〔16〕證實(shí)miR-143/miR-145簇可通過(guò)靶向結(jié)合ERBB3 3'UTR抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，并抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)，但miR-143在AML中的作用還有待深入研究。本研究結(jié)果顯示，在AML患者血漿和細(xì)胞中miR-143表達(dá)水平顯著下調(diào)。Elhamamsy等〔17〕通過(guò)對(duì)65例AML患者血樣中的miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，miR-143水平較正常人血樣明顯降低，與本研究結(jié)果相一致。為探究miR-143對(duì)AML細(xì)胞表型的影響，本研究通過(guò)在HL60細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-143 mimics成功構(gòu)建miR-143過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型，并采用Transwell小室法證實(shí)miR-143過(guò)表達(dá)可抑制HL60細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

隨著對(duì)腫瘤研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)有氧條件下的糖酵解上調(diào)可通過(guò)調(diào)控腫瘤相關(guān)信號(hào)通路活性促進(jìn)腫瘤生成〔18,19〕。利用糖酵解途徑抑制劑作用癌細(xì)胞后，可抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)〔20,21〕，因此，通過(guò)對(duì)糖酵解途徑相關(guān)蛋白進(jìn)行研究將為腫瘤的臨床治療提供新思路。HK2是糖酵解途徑中的一種限速酶，可通過(guò)調(diào)控糖代謝途徑參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，在多種腫瘤組織和細(xì)胞中均檢測(cè)到HK2的異常高表達(dá)〔22～24〕。研究證實(shí)，在肺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤中，HK2的表達(dá)和功能均受miR-143的調(diào)控〔25,26〕，但二者在AML發(fā)生中的相互調(diào)控還未有研究。為進(jìn)一步探究miR-143是否通過(guò)靶向抑制HK2影響AML細(xì)胞的侵襲和遷移，本研究對(duì)miR-143的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，結(jié)果證實(shí)HK2是miR-143的一個(gè)靶基因，且miR-143可在轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控HK2表達(dá)。

綜上所述，miR-143在AML患者血漿和細(xì)胞中表達(dá)量降低，與HK2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；上調(diào)miR-143可通過(guò)靶向抑制HK2抑制HL60細(xì)胞的遷移和侵襲，最終緩解AML進(jìn)程，miR-143/HK2調(diào)控通路的提出將為AML的生物靶向治療提供理論支持。