郭俞利 朱佩文 葉蕾 徐曉瑋 劉鈺鑫 石文卿 袁晴 閔幼蘭 劉佳祥 邵毅

(1南昌大學第一附屬醫(yī)院眼科，江西 南昌 330006；2廈門大學眼科研究所)

研究表明，多種影響因素共同作用造成干眼癥，引起眼部感覺不適、視物模糊及淚膜不穩(wěn)定，同時伴有淚膜滲透壓增加和眼表炎癥，極大可能損害眼表結構〔1〕。研究認為干眼癥發(fā)病與雄激素、雌激素的作用具有很大的關聯(lián)。雄激素、雌激素、孕激素和催乳素受體在人、兔和鼠的淚腺、瞼板腺和角膜等組織中廣泛分布〔2〕。性激素有著維持淚膜穩(wěn)定，減緩局部炎癥的作用。性激素水平下降，會對眼表穩(wěn)定造成影響，導致干眼癥的形成。目前臨床上治療雄激素水平異常導致的干眼癥一般采用局部對癥治療。雄激素替代治療也是一種行之有效的治療方法，但該法副作用多，患者接受度較低。桑色素來源于黃桑木、桑橙樹等?？浦参锏臉淦ず驮S多中草藥。作為一種黃體酮類化合物，它可以抑制酶活性。研究闡明桑色素在抗癌、抗菌、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、降低血糖和抗應激方面的應用效果顯著〔3，4〕。桑色素與雄激素相似的結構使其與細胞表面雄激素受體結合發(fā)揮微弱雄激素效應，但不會因全身雄激素補充過多產(chǎn)生副作用，在雄激素水平下降時補充桑色素可能具有獨到的效果。本研究旨在探究桑色素滴眼劑對雄激素缺乏引起的干眼癥的預防作用。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器 試劑：?？浦参飿淦?、羧甲基纖維素購自美國艾爾建公司(批號H20100046)、鹽酸乙醇溶液購自天津市化學試劑廠(批號20100124)、氯仿購自天津市化學試劑廠(批號20050915)、NaHCO3(批號H35021110)及KCl(批號H41021043)購自福州海王福制藥有限公司、小牛血清白蛋白購自美國Sigma公司(批號B3251)、溶菌酶購自南京東恒華道生物科技有限公司(批號14010607)、放射免疫藥盒購自原子高科技有限公司(批號S10950107)、0.5%鹽酸丙美卡因(愛爾卡因)滴眼液購自美國愛爾康公司(批號0612813，進口藥品注冊號H20040046)、 注射青霉素鈉鹽購自哈藥集團制藥總廠(國藥準字H23021439)、安爾碘購自上海利康消毒高科技有限公司(滬衛(wèi)消證字2003 第0001 號)、鹽酸利多卡因注射液購自成都第一制藥有限公司(批號H51021661)、角膜熒光素購自廣州白云山明興制藥有限公司(批號080201)、苯扎溴胺購自江西德成制藥有限公司(國藥準字H36020927)、4，6-亞乙基-對硝基苯-α-D-麥芽七糖苷(LPS-PNP-G7)購自上海西寶生物科技股份有限公司(批號CAS：96597-16-9)。器材：淚液分泌檢測濾紙購自天津晶明新技術開發(fā)有限公司(批號140001)，裂隙燈購自上海博覽光電儀器有限公司，角膜共焦顯微鏡購自日本Nidek Co.LTD，眼底鏡購自太湖華美醫(yī)療器材有限公司。

1.2實驗動物分組與手術方法 選取雄性、6周齡、體重2.0～2.5 kg的新西蘭大白兔36只，由南昌大學動物實驗室提供。用裂隙燈顯微鏡檢查眼前節(jié)無異常，同時用眼底鏡檢查眼底無異常。Schirmer I試驗標準(SIT)≥10 mm/5 min。按照文獻報道的方法〔5〕，為36只雄兔行雙側睪丸切除術(ORX)。隨機選取其中的24只分為2組(每組12只，均為右眼)，分別為實驗(A)組(使用桑色素滴眼劑)和對照(B)組〔使用磷酸鹽緩沖液(PBS)〕，連續(xù)滴眼6 w，4次/d。剩余的12只雄兔只做手術，術后不滴眼液，作為模型組。為預防感染，在術前肌肉滴注青霉素針20萬U，術后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素針20萬U。分別于術前、術后2 w、4 w及6 w對各組進行SIT檢查、角膜熒光素染色(FL)、淚液蛋白測定及角膜共聚焦顯微鏡掃描。

1.3桑色素提取液的制備 用70%乙醇提取?？浦参飿淦ぃ喝∩淦?0 g，第1次加入8倍量乙醇，第2次加入6倍量乙醇，減壓回收乙醇至無醇味，收取濃縮液。真空干燥濃縮液后將其粉碎。隨后，依次用氯仿和乙酸乙酯萃取，每次加入6倍量，得到桑色素提取液。

1.4桑色素滴眼劑的制備 提取的桑色素提取液以水∶提取物質量比為1.0∶0.1用蒸餾水溶解，加入眼潤滑劑羧甲基纖維素，控制濃度為1.5 g/L。加入碳酸氫鈉及氯化鉀緩沖，濃度為0.1 g/L以下。檢測其pH值、滲透壓、比重、表面張力、黏稠度和屈光指數(shù)，根據(jù)如下標準調(diào)整桑色素提取物、眼潤滑劑、緩沖系統(tǒng)的含量：①pH值：7.3～7.8；②滲透壓：311～350 mOsm；③比重：約等于1；④表面張力：40～50 dyn/cm2；⑤黏稠度：略高于水；⑥屈光指數(shù)：1.336。最后加入保存劑0.05 g/L苯扎溴銨。

1.5檢查方法

1.5.1基礎淚液分泌SIT檢測及FL 首先取有刻度的試紙5 mm×35 mm，將檢測淚液分泌的濾紙一端彎折置于被測眼下結膜囊中外1/3處，靜置5 min后取出濾紙，測量并記錄淚液浸潤的長度。參照文獻的標準〔6〕：≥10 mm/5 min為正常，≥5 mm/5 min且<10 mm/5 min為低分泌狀態(tài)，<5 mm/5 min為干眼。在檢查過程中注意以下幾點：由同一操作者在相同時間、地點、溫度、濕度及照明光度下操作。角膜熒光素染色：將1滴10 g/L熒光素鈉滴眼，輔助其瞬目，評分采用12分法：將角膜劃分為4個象限，依據(jù)染色情況分為0～3分/象限，無染色為0分，<5個點計為1分，≥5個點計為2分，≥5個點并有絲狀物染色或潰瘍計為3分〔7〕。

1.5.2淚液蛋白、乳鐵蛋白、溶菌酶含量和淀粉酶活性測定 用毛細吸管在實驗動物9點到11點位置下淚河吸取約 20 μl非刺激性淚液。采集的淚液置于-80℃冰箱中保存。以小牛血清白蛋白為標準，Brandford法檢測淚液總蛋白含量。乳鐵蛋白的含量：使用放射免疫分析法測定〔8〕，取淚液10 μl，用生理鹽水以1∶100稀釋，制作標準曲線，樣品中乳鐵蛋白含量在曲線上查出。溶菌酶含量：使用試管比濁法測定，將淚液及染色菌液混勻，離心后選取上清液，根據(jù)測定管與樣品對照管光密度差值，查標準曲線。淀粉酶活性〔9〕：使用EPS-PNP-G7作為底物檢測。

1.5.3共聚焦顯微鏡檢查 采用共聚焦顯微鏡檢查兔角膜上皮情況，對各組被測眼角膜上皮的變化情況進行評估。由同一個研究員進行操作：用 5% 愛爾卡因將兔眼表面麻醉，固定其頭部于顯微鏡前，使用開瞼器暴露角膜，將鏡頭向前推進，全層掃描中央角膜處，觀察視野為400 μm×400 μm，分辨率1 μm，放大倍數(shù) 800倍觀察兔角膜上皮基底層細胞的形態(tài)變化，檢測完畢存儲數(shù)據(jù)，計算角膜上皮基底細胞和炎癥細胞的密度。角膜上皮基底膜下神經(jīng)密度的測定：用共聚焦顯微鏡觀察角膜下神經(jīng)叢。采用AUTOCAD軟件確定角膜下神經(jīng)纖維的長度，并對單個圖像進行神經(jīng)纖維形狀描繪。按照比例，用所描繪的折線特征確定折線的總長度，并將所得總長度除以面積就是神經(jīng)纖維密度(mm/mm2)。神經(jīng)纖維分支：為每個圖像中看到的神經(jīng)總分支數(shù)。曲率評分：分數(shù)越高，神經(jīng)纖維曲率越高，神經(jīng)纖維彎曲度越高〔10〕。本研究實驗符合動物倫理委員會要求〔11〕。

1.6統(tǒng)計分析 采用GraphPad Prism4.00軟件進行χ2檢驗、單因素方差分析及Dunnett-t檢驗。

2 結 果

2.1各組干預前后基礎淚液分泌SIT檢查 干預前3組的基礎淚液分泌量無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；干預4 w、6 w后，模型組和B組SIT 較干預前有明顯惡化(P<0.05)；而A 組干預后2 w、4 w、6 w均較干預前改善(P<0.05)，且與B組和模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3組FL 評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05) ；干預后，模型組和B組FL評分較干預前明顯增加(P<0.05)，提示角膜狀況明顯惡化；而A組FL評分在干預6 w后較干預前比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但相較于模型組和B組，A組干預后各個時間點的FL評分明顯降低(P<0.05)，提示角膜狀況明顯改善。見表1。

表1 3組各時段SIT和FL比較

與模型組比較：1)P<0.05；與B組比較：2)P<0.05 ；與干預前比較：3)P<0.05 ；下表同

2.2各組干預前后淚液蛋白比較 3組在干預前淚液總蛋白量、乳鐵蛋白、溶菌酶水平及淀粉酶活性差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05) 。干預2 w、4 w及6 w后，模型組和B組淚液總蛋白量、溶菌酶水平及淀粉酶活性與治療前相比有不同程度下降(P<0.05)，干預6 w后模型組乳鐵蛋白顯著低于干預前(P<0.05)。A組各指標與治療前相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05) ，與模型組和B組相比均有不同程度的提高(P<0.05)。見表2。

表2 3組干預前后淚液蛋白比較

2.3各組共聚焦顯微鏡結果 用共聚焦顯微鏡觀察正常角膜上皮基底細胞的胞體較暗，邊界較窄 。干預前3組的角膜上皮基底細胞均為正常狀態(tài)，鮮有炎癥細胞；而各組干預6 w后，B組和模型組角膜上皮基底細胞密度明顯增加，可以發(fā)現(xiàn)較多光較亮的炎癥細胞，但A組上皮基底細胞密度與干預前相比無明顯變化，存在極少量光亮的炎癥細胞。見圖1。細胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)，干預6 w后，3組角膜上皮基底細胞計數(shù)均較治療前明顯增加(P<0.05)，且A組高于模型組和B組(P<0.05)。且干預6 w后，與模型組和B組相比，A組炎癥細胞計數(shù)明顯減少(P<0.05)。共聚焦顯微鏡觀察角膜上皮基底膜下神經(jīng)的分布可見，干預前3組的各項指標差異均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。模型組和B組在干預后神經(jīng)纖維密度明顯減少，曲率評分明顯升高(均P<0.05)，角膜上皮基底膜下神經(jīng)纖維分支無明顯變化(P>0.05)。干預后，除干預4 w和6 w 后A組角膜上皮下神經(jīng)纖維密度較干預前顯著下降外(P<0.05)，其余各項指標較干預前差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；且A組角膜上皮基底膜下神經(jīng)纖維密度、分支數(shù)量和曲率評分的結果均顯著優(yōu)于B組和模型組(P<0.05)。見表3。

圖1 3組角膜上皮下基底細胞情況(×800)

組別神經(jīng)纖維密度(mm/mm2)干預前干預2 w干預4 w干預6 w纖維分支(分支數(shù)/圖)干預前干預2 w干預4 w干預6 w模型組18.11±2.4317.16±2.163)15.72±2.673)13.54±2.433)7.08±0.777.27±0.877.49±0.847.53±0.91A組18.24±2.1618.17±2.111)2)17.24±2.061)2)3)17.19±2.191)2)3)7.03±0.796.92±0.621)2)6.88±0.731)2)6.91±0.691)2)B組18.28±2.0917.03±2.113)15.86±2.833)13.67±2.923)7.01±0.737.28±0.917.36±0.937.45±0.92F值1.9214.9317.7659.4311.5125.2758.87411.299P值0.9450.0390.0310.0190.9920.0420.0260.012組別曲率評分(分)干預前干預2 w干預4 w干預6 w角膜上皮基底細胞計數(shù)(個/mm2)干預前干預6 w干預6 w炎癥細胞計數(shù)(個/mm2)模型組2.75±0.433.34±0.493)3.74±0.513)4.12±0.623)2994±1794522±2253)281±113A組2.71±0.422.67±0.391)2)2.69±0.371)2)2.72±0.381)2)3032±2013121±2241)2)43±161)2)B組2.83±0.463.21±0.523)3.69±0.543)4.04±0.583)3093±1934321±2163)265±102F值1.3264.3849.54213.7821.029.39112.571P值0.9620.0330.0210.0110.9170.0110.023

3 討 論

干眼癥在世界各地的發(fā)病率為5%～35%〔12〕，而在我國，干眼癥的發(fā)病率居高不下甚至逐年升高。關于引發(fā)干眼癥的危險因素也是時下研究的熱點。文獻報道〔13，14〕，視頻終端大范圍長時間的使用及睡眠休息得不到充分補充是干眼癥發(fā)病的元兇。研究同時也表明性激素失調(diào)也是干眼癥主要發(fā)病機制之一。除了調(diào)控機體性征發(fā)育外，雄激素還能調(diào)節(jié)機體及局部的免疫功能。研究表明〔15〕，雄激素可以調(diào)節(jié)淚腺和瞼板腺的形態(tài)、發(fā)育、分化及分泌功能，且對眼的淚液穩(wěn)定、炎癥反應及細胞凋亡有重要的調(diào)節(jié)作用。Stern等〔16〕認為如果機體的雄激素過低，則不足以維持眼表淚液的穩(wěn)定性，造成眼表干燥，從而刺激淚腺神經(jīng)，引發(fā)炎癥反應，炎癥反應又加劇了眼表干燥的程度，造成惡性循環(huán)。由此可見，雄激素水平對眼表正常狀態(tài)的維持起著重要作用。而在臨床上，衰老、自身免疫性疾病等全身性的機體變化往往會導致雄激素水平降低，這也使雄激素降低引發(fā)的干眼癥越來越常見。

雄激素替代療法也是目前此類干眼癥患者唯一的對因治療方法〔10〕。但男性患者前列腺肥大甚至腫瘤、女性男性化等都是很嚴重的副作用。黃酮類物質可與細胞膜雄激素受體結合，是一種細胞膜雄激素受體刺激物〔17〕，可用作雄激素治療的替代物。桑色素臨床上可用于抗病毒感染，也可用于緩解頭痛、治療胃病和冠心病〔18〕。與其他黃酮類物質相似，桑色素也可與雄激素受體結合起到擬雄激素活性作用。運用桑色素滴眼液可發(fā)揮其擬雄激素的作用，改善淚腺、瞼板腺的分泌情況，從而減輕全身和眼局部自身免疫反應，抑制淚腺和角膜局部細胞凋亡，最終達到治療干眼癥的目的。

本實驗證明，預防性使用桑色素滴眼液在干預6 w后可明顯改善去勢雄兔干眼SIT 和改變淚液蛋白成分，PBS 治療則改善不明顯。同時，預防性使用桑色素滴眼液還可以顯著減少角膜的炎癥細胞浸潤和角膜上皮基底細胞萎縮，可能與桑色素的抗炎和抗氧化作用有關。Arima等〔19〕研究表明，桑色素可能通過抑制前列腺素(PG) 生物合成過程中的脂氧化酶(LOX)、蛋白激酶(PK)C等活性從而調(diào)控對免疫和炎癥的抑制作用。

綜上，桑色素滴眼液可明顯地改善雄激素缺乏引起的干眼癥，并且在維持淚液蛋白成分方面有顯著作用。與傳統(tǒng)的雄激素替代療法相比，預防性使用桑色素滴眼液安全有效，而且給藥途徑簡單、副反應少。此外，桑色素抗炎抗氧化的作用還可以預防糖尿病視網(wǎng)膜改變〔20〕等疾病。但進一步臨床試驗及預防保健研究還需大樣本數(shù)據(jù)調(diào)查。另外，提前用藥時間、用藥周期、藥物效果的穩(wěn)定性及作用機制等還需深入研究。