馬建欣 馬永新 熊勝春

(1承德市中心醫(yī)院心胸外科，河北 承德 067000；2承德市第三醫(yī)院腫瘤科)

研究肺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的靶基因提高腫瘤患者的生存率是目前研究的重點(diǎn)〔1，2〕。組氨酸磷酸酶蛋白(PHP)14是一種發(fā)現(xiàn)于高等脊椎動(dòng)物中的PHP，目前對其生物學(xué)特性的研究較少，在肺癌中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平高于正常組織，并且與肺癌患者的病理特征有關(guān)，通過小干擾核糖核酸(siRNA)技術(shù)下調(diào)肺癌細(xì)胞中PHP14的表達(dá)后，細(xì)胞的凋亡水平增加，推測其可能參與肺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性的發(fā)揮〔3，4〕。本實(shí)驗(yàn)旨在探討PHP14對肺癌細(xì)胞皮下移植瘤生長的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要材料 Balb/c-nu裸鼠購自承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；Lipfectamine2000、Opti-MEMⅠReduced Serum Medium購自Invitrogen公司；RNA提取試劑盒購自MRC公司；RNA提取試劑盒、互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)合成試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)試劑盒均購自大連寶生物公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抗體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子(STAT)3抗體購自美國CTS；磷酸化(p)-STAT3抗體、p-p38MAPK抗體、PHP14抗體購自美國BioVision；pSEB-HUS-PHP14 siRNA1、pSEB-HUS-PHP14 siRNA2由承德市中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

1.2細(xì)胞株 A549細(xì)胞在含有100 U/ml的鏈霉素及青霉素、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，在溫度為37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2～3 d進(jìn)行傳代，傳代用0.25%的胰蛋白酶。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞以不同的處理方法分為對照組、陰性組、干擾1組、干擾2組。干擾1組、干擾2組細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pSEB-HUS-PHP14 siRNA1和pSEB-HUS-PHP14 siRNA2，陰性組細(xì)胞中轉(zhuǎn)染含有sRNA的陰性對照的質(zhì)粒，對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)只加入轉(zhuǎn)染試劑。6孔培養(yǎng)板中每孔加入2 ml A549細(xì)胞懸浮液(約1.5×105個(gè)細(xì)胞)，孵育24 h至細(xì)胞融合度為60%，把250 μl的Opti-MEMⅠReduced Serum Medium同PHP14 sRNA和sRNA陰性對照混合后，再與Lipfectamine2000混合，室溫孵育15 min，每孔加入500 μl的上述混合物，孵育6 h，棄上清，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育48 h。傳代后，用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.4qRT-PCR測定PHP14表達(dá) 取上述轉(zhuǎn)染后的對照組、陰性組、干擾1組、干擾2組細(xì)胞，用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用qRT-PCR試劑盒分析PHP14表達(dá)水平。內(nèi)參基因GAPDH引物序列：上游5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，下游5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。PHP14引物序列：上游5′-TCAGTAGCCGTCGTTAGCC-3′，下游5′-TGCGACTGTGAGTGTCTGGG-3′。

1.5Western印跡法測定PHP14表達(dá) 取上述轉(zhuǎn)染后的對照組、陰性組、干擾1組、干擾2組細(xì)胞，提取細(xì)胞中的總蛋白，步驟同試劑盒說明書。提取的各組蛋白樣品用二喹啉甲酸(BCA)法測定濃度后，每個(gè)泳道加40 μg蛋白樣品進(jìn)行蛋白電泳，凝膠用10%分離膠、5%積層膠。蛋白樣品在上樣前進(jìn)行變性處理(與等體積的2×上樣緩沖液煮沸5 min)；積層膠90 V電壓電泳，分離膠120 V電壓電泳；4℃，90 V，轉(zhuǎn)膜2 h；5%牛血清白蛋白室溫中封閉2 h，1∶600稀釋一抗，4℃過夜，與1∶2 000稀釋的二抗置于室溫中孵育2 h)。電化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測，用Image J軟件進(jìn)行目的條帶定量分析，內(nèi)參為GAPDH。

1.6噻唑藍(lán)(MTT)測定細(xì)胞體外增殖 對照組、陰性組、干擾1組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h分別加入MTT溶液，培養(yǎng)4 h，棄上清，再添加150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，孵育反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm處的OD值。

1.7肺癌細(xì)胞皮下移植瘤實(shí)驗(yàn) Balb/c-nu裸鼠，體重18～22 g，4～6周齡，隨機(jī)分成3組。將上述對照組、陰性組、干擾1組細(xì)胞配制成細(xì)胞懸浮液，取100 μl的細(xì)胞懸浮液(含5×106個(gè)細(xì)胞)種植到裸鼠右前肢皮下，分別在7 d、14 d、21 d、28 d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長度和寬度，計(jì)算腫瘤體積。并在28 d處死各組裸鼠，測定皮下移植瘤的重量，同時(shí)取腫瘤組織，用Western印跡法檢測組織中的STAT3、p38MAPK、p-STAT3、p-p38MAPK蛋白水平，步驟同1.5。

1.8統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染后各組肺癌細(xì)胞中PHP14 mRNA和蛋白的表達(dá) 干擾1組、干擾2組肺癌細(xì)胞中的PHP14 mRNA和蛋白水平均明顯低于對照組(P<0.05)，且干擾1組顯著低于干擾2組(P<0.05)，陰性組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PHP14 siRNA可以沉默肺癌細(xì)胞中PHP14 mRNA的表達(dá)，選取干擾效果更好的PHP14 siRNA1做后續(xù)研究。見表1。

表1 siRNA轉(zhuǎn)染后各組肺癌細(xì)胞PHP14的表達(dá)

與對照組比較：1)P<0.05；與干擾1組比較：2)P<0.05

2.2沉默PHP14對肺癌細(xì)胞體外增殖的影響 與對照組比較，24 h開始干擾1組肺癌細(xì)胞OD值明顯降低(P<0.05)，而陰性組OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 下調(diào)PHP14后各時(shí)點(diǎn)各組肺癌細(xì)胞體外增殖情況

與對照組比較：1)P<0.05；下表同

2.3沉默PHP14對肺癌細(xì)胞皮下移植瘤生長的影響 干擾1組肺癌細(xì)胞皮下移植瘤體積顯著小于對照組(P<0.05)，28 d時(shí)腫瘤重也顯著小于對照組(P<0.05)，而陰性組肺癌細(xì)胞腫瘤體積和腫瘤重量與對照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 下調(diào)PHP14后各時(shí)點(diǎn)各組肺癌細(xì)胞皮下移植瘤的體積及瘤重

2.4沉默PHP14對肺癌細(xì)胞皮下移植瘤中STAT3、p38MAPK磷酸化的影響 沉默PHP14后肺癌細(xì)胞p-STAT3、p-p38MAPK表達(dá)顯著低于STAT3、p38MAPK，見圖1。干擾1組肺癌細(xì)胞皮下移植瘤中p-STAT3/STAT3水平顯著降低、p-p38MAPK/p38MAPK水平顯著升高(均P<0.05)，而陰性組與對照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

圖1 Western印跡法檢測各組皮下移植瘤組織中STAT3和p38MAPK磷酸化水平

組別p-STAT3/STAT3p-p38MAPK/p38MAPK對照組0.30±0.050.23±0.02陰性組0.29±0.060.22±0.04干擾1組0.12±0.021)0.53±0.061)F/P值14.169/0.00549.875/0.000

3 討 論

腫瘤的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，是一個(gè)多基因共同參與調(diào)控的過程，目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與肺癌相關(guān)的基因，在腫瘤組織中發(fā)揮抑制或促進(jìn)作用，具有調(diào)控細(xì)胞不同生物學(xué)特性的功能〔5～8〕。PHP14是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)存在于哺乳動(dòng)物中的PHP，目前發(fā)現(xiàn)了很多與組氨酸磷酸化相關(guān)的蛋白參與腫瘤細(xì)胞的相關(guān)生物學(xué)特性過程中，PHP14可能也參與腫瘤的發(fā)生〔9，10〕。在肺癌組織中的研究表明，PHP14在腫瘤中高表達(dá)，在35例肺癌組織中有約65%的組織中存在PHP14 mRNA的高表達(dá)，并且與腫瘤患者的臨床特征有關(guān)〔3，11〕。在肺癌細(xì)胞中下調(diào)PHP14表達(dá)后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測定發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞凋亡率明顯升高〔4〕。本研究表明，PHP14沉默后的肺癌細(xì)胞的體外增殖能力降低，提示PHP14在肺癌發(fā)生中可能發(fā)揮抑制作用。腫瘤的生長與腫瘤細(xì)胞異常增殖有關(guān)，是腫瘤無限惡性增殖的結(jié)果。腫瘤的生長是一個(gè)多種基因、多步驟調(diào)控的復(fù)雜過程，除了與細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)外，還與細(xì)胞生長的微環(huán)境有關(guān)，裸鼠皮下成瘤是常用的檢測細(xì)胞生物學(xué)特性的模型，也是常用的檢測抗腫瘤藥物或癌基因、抑癌基因?qū)δ[瘤生長、轉(zhuǎn)移等作用的體內(nèi)模型〔11～14〕。本研究表明，沉默PHP14表達(dá)后可以在體內(nèi)抑制肺癌細(xì)胞的生長。

STAT3信號(hào)通路是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其激活水平的高低與胚胎發(fā)育、神經(jīng)生長等有關(guān)，在心血管系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病等多種疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用〔15～17〕。STAT3信號(hào)通路與腫瘤發(fā)生有關(guān)，在腫瘤組織中異常激活，而在正常的組織中激活水平較低，STAT3只有在磷酸化后才可發(fā)揮其生物學(xué)特性，影響細(xì)胞的生長等過程〔18，19〕。p38MAPK信號(hào)通路是MAPK的分支，其磷酸化水平升高后可以抑制細(xì)胞的增殖，在腫瘤組織中激活水平較低，激活p38MAPK信號(hào)通路可抑制腫瘤細(xì)胞的生長〔20～22〕。本研究說明沉默PHP14抑制了移植瘤中STAT3信號(hào)通路的激活，促進(jìn)了p38MAPK信號(hào)通路的激活。

PHP14參與肺癌發(fā)生過程，與肺癌細(xì)胞生長有關(guān)，其作用機(jī)制可能與STAT3和p38MAPK信號(hào)通路有關(guān)，PHP14可能是基因靶向治療的潛在靶點(diǎn)。