姚嘉明 陳芝蕓 陳曦 劉彬彬 葉蔚 張潔

作者單位：310007 杭州市中醫(yī)院（姚嘉明 劉彬彬 葉蔚 張潔）

310006 浙江省中醫(yī)院（陳芝蕓）

641000 四川省內(nèi)江市第一人民醫(yī)院（陳曦）

肝內(nèi)膽汁淤積是一種臨床常見(jiàn)病，指因各種原因?qū)е履懼男纬?、分泌和（或）排泄出現(xiàn)異常，出現(xiàn)肝內(nèi)膽汁酸和其他有毒化合物積累引起肝損傷的病理狀態(tài)。該病發(fā)生原因復(fù)雜，常見(jiàn)病因主要有病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、藥物和/或毒物、自身免疫、雌激素、酒精、全胃腸外營(yíng)養(yǎng)、腫瘤和遺傳代謝等。膽汁淤積與腸道微生態(tài)破壞可互為因果，探索肝內(nèi)膽汁淤積發(fā)病時(shí)腸道菌群的變化對(duì)該病的防治具有重要意義。作者自2015年1月至2018年9月使用ANIT間歇性多次給藥成功建立了亞急性肝內(nèi)膽汁淤積大鼠模型，并取新鮮糞便進(jìn)行16s rRNA高通量測(cè)序觀察其腸道菌群結(jié)構(gòu)變化情況，旨在為該病的腸道微生態(tài)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供必要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠16只，雄性，清潔級(jí)，體重190～210g，由上海市西普-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（滬）2013-0016。

1.2 主要試劑 異硫氰酸萘酯（ANIT）由上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司提供。

1.3 分組及處理 16只SD大鼠隨機(jī)分成正常組和模型組，每組各8只。模型組于實(shí)驗(yàn)第1天灌服1.6%濃度的異硫氰酸萘酯（麻油配制）80mg/kg，1次/周，連續(xù)4次，末次灌胃后48h處理大鼠；正常組以等容量的麻油灌胃代替；所有大鼠予以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水。各大鼠于處理前16h禁食不禁水，空腹麻醉下取血，分離血清待用；于大鼠腹部去毛局部消毒，剖腹無(wú)菌取回盲部新鮮腸內(nèi)容物放入滅菌EP 管，液氮凍存后送檢進(jìn)行16s rDNA測(cè)序分析。

1.4 檢測(cè)方法 采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、總膽汁酸（TBA）、總膽紅素（TBIL）水平。采用磁珠法提取大鼠腸內(nèi)容物DNA，16s rRNA基因測(cè)序方法進(jìn)行腸道菌群檢測(cè)，由杭州谷禾信息技術(shù)公司采用Illumina MiSeq測(cè)序儀完成，平均每個(gè)樣本的clean reads≥10萬(wàn)條，使用高可變區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物建庫(kù)，用QIIME軟件進(jìn)行菌群豐度、多樣性及組成等分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件包。計(jì)量資料符合或近似符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)，以（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較；不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 亞急性肝內(nèi)膽汁淤積大鼠血清肝功能水平的變化 見(jiàn)表1。

注：與正常組比較，*P＜0.01

2.2 亞急性肝內(nèi)膽汁淤積大鼠糞便16s rRNA高通量測(cè)序分析 （1）測(cè)序概況：總共測(cè)得了704424個(gè)樣本序列，其中578567個(gè)序列獲得了OTUs（operational taxonomic units）注釋。分析結(jié)果顯示，模型組測(cè)得的樣本序列數(shù)目、OTU數(shù)目、注釋上OTU的序列數(shù)目較正常組均明顯減少（見(jiàn)表2，P＜0.01），提示模型組大鼠腸道菌群豐度較正常組降低。（2）各組樣本Alpha多樣性分析：Alpha 多樣性反映的是單個(gè)樣本內(nèi)部的物種多樣性，包括ACE指數(shù)、chaol指數(shù)、coverage、shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)等。本研究對(duì)各組樣本的alpha多樣性進(jìn)行計(jì)算，并繪制出相應(yīng)Shannon-Winner曲線。①各組菌群豐度評(píng)估：通過(guò)ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)評(píng)估兩組樣本的菌群豐度。結(jié)果顯示，ANIT灌胃后大鼠腸道菌群豐度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。②各組菌群多樣性分析：通過(guò)shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)評(píng)估各組樣品菌群多樣性。結(jié)果顯示，兩組大鼠腸道菌群多樣性未見(jiàn)顯著性差異（P＞0.05）。見(jiàn)表3。③樣品文庫(kù)覆蓋率評(píng)估：為衡量樣本取樣深度，進(jìn)行Coverage指數(shù)和Shannon-Winner曲線分析。各組樣本Coverage 指數(shù)均趨近于96 %（見(jiàn)表2），提示測(cè)序深度已經(jīng)基本能夠覆蓋該微生物群落中絕大多數(shù)細(xì)菌。各樣本的Shannon-Winner曲線趨于平坦，表明測(cè)序已趨于飽和，測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息，適合下一步的數(shù)據(jù)分析和研究。（3）各組大鼠腸道菌群門水平豐度分析：模型組大鼠糞便樣品中OTU總數(shù)較正常組明顯減少（見(jiàn)表4，P＜0.01），兩組樣本優(yōu)勢(shì)菌門包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門。正常組覆蓋19個(gè)菌門，以擬桿菌門（Bacteroidetes）占比最高，其次分別為厚壁菌門（Firmicutes）及變形菌門（Proteobacteria），分別占51%、40%、6%，模型組覆蓋17個(gè)菌門，擬桿菌門（Bacteroidetes）比例較正常組有升高趨勢(shì)，其余兩門比例較正常組下降，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表 5。

表2 樣本測(cè)序概況（±s）

表2 樣本測(cè)序概況（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01

分組 n SampleSize OTUsNumber OTUsSeq Coverage模型組 8 37308.63±9185.27* 2342.75±334.76*29821.38±8445.769* 0.95±0.01正常組 8 50744.38±5743.58 3141.75±307.81 42499.50±5427.72 0.96±0.01

表3 各組樣本Alpha多樣性分析（中位數(shù)及四分位數(shù)間距）

表4 各組大鼠糞便各水平OTU數(shù)量（±s）

表4 各組大鼠糞便各水平OTU數(shù)量（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01

分組 n 門 綱 科模型組 8 1792.88±243.32* 1792.88±243.32* 1581.88±222.29*正常組 8 2366.38±218.60 2366.38±218.60 2079.88±197.90

表5 各組大鼠糞便中菌群門水平相對(duì)豐度變化［%，（±s）］

表5 各組大鼠糞便中菌群門水平相對(duì)豐度變化［%，（±s）］

菌門 正常組 模型組Bacteroidetes 51.24±15.24 58.29±9.59 Firmicutes 40.53±12.43 36.11±8.86 Proteobacteria 6.71±3.66 4.42±1.25

2.3 各組大鼠腸道菌群綱水平豐度分析 正常組測(cè)得36個(gè)菌綱，模型組測(cè)得30個(gè)菌綱。兩組大鼠糞便樣品中綱水平占比居前10位分別為擬桿菌綱（Bacteroidia）、 梭 狀 芽 胞 桿 菌 綱（Clostridia）、δ-變 形 菌 綱（Deltaproteobacteria）、γ-變 形 菌綱（Gammaproteobacteria）、 芽 孢 桿 菌 綱（Bacilli）、β-變 形 菌 綱（Betaproteobacteria）、ε-變 形 菌綱（Epsilonproteobacteria）、4C0d-2、 產(chǎn) 芽 胞 菌 綱（Erysipelotrichi）、Coriobacteriia。見(jiàn)表 6。

表6 各組大鼠糞便中菌群綱水平相對(duì)豐度變化［%，（x±s）］

2.4 各組大鼠腸道菌群科水平豐度分析 正常組測(cè)得72個(gè)菌科，模型組測(cè)得70個(gè)菌科。各組大鼠糞便樣品中科水平占比居前12位分別為普雷沃菌科（Prevotellaceae）、疣微菌科（Ruminococcaceae）、S24-7、Paraprevotellaceae、 毛 螺 菌 科（Lachnospiraceae）、韋榮氏球菌科（Veillonellaceae）、脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、 擬 桿 菌 科（Bacteroidaceae）、腸 桿 菌 科（Enterobacteriaceae）、 紫 單 胞 菌 科（Porphyromonadaceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、螺桿菌科（Helicobacteraceae）。見(jiàn)表7。

表7 各組大鼠糞便中菌群科水平相對(duì)豐度（%）變化（±s，n=8）

表7 各組大鼠糞便中菌群科水平相對(duì)豐度（%）變化（±s，n=8）

注：與正常組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

菌科 正常組 模型組Prevotellaceae 17.30±9.96 23.66±12.80 Ruminococcaceae 15.60±3.48 18.15±5.23 S24-7 16.09±4.52 21.41±7.42［Paraprevotellaceae］ 15.99±10.20 12.55±6.19 Lachnospiraceae 10.81±9.02 6.47±3.13 Veillonellaceae 9.65±5.45 6.06±1.69 Desulfovibrionaceae 6.04±3.40 1.80±1.25*Bacteroidaceae 3.78±2.60 3.33±1.17 Enterobacteriaceae 0.36±0.35 1.01±1.04 Porphyromonadaceae 0.78±0.65 0.76±0.84 Lactobacillaceae 0.51±0.29 0.74±0.34 Helicobacteraceae 0.22±0.17 1.16±0.90*#

3 討論

ANIT是一種能造成膽汁淤積性肝炎的肝毒劑，被廣泛用于急性肝內(nèi)膽汁淤積相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究，動(dòng)物一次性灌服該藥物后可出現(xiàn)與人類膽汁淤積性肝炎相似的血清生化學(xué)及肝組織病理學(xué)改變，48h達(dá)疾病高峰，后肝功能逐漸恢復(fù)，為一種自限性過(guò)程，項(xiàng)目組前期研究也證實(shí)了這種現(xiàn)象［1］。該法主要優(yōu)勢(shì)為造模方便、成功率高。目前其具體作用機(jī)制仍未完全闡明。有研究表明，ANIT在體內(nèi)可誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，中性粒細(xì)胞被活化，釋放大量的氧自由基［2］。ANIT所引起的脂質(zhì)過(guò)氧化水平增加可能是導(dǎo)致膽汁淤積性肝炎病變發(fā)生的初始階段，而病理學(xué)改變則是其后續(xù)階段［3］。1998年，Marshall提出了“腸－肝軸”的概念，目前許多臨床研究也已證實(shí)膽汁淤積時(shí)腸道菌群與發(fā)病密切相關(guān)。肝內(nèi)膽汁淤積發(fā)生后，由肝臟分泌的膽汁無(wú)法順利進(jìn)入腸道，從而引起肝臟代謝功能紊亂，肝功能嚴(yán)重受損，腸道內(nèi)缺乏膽汁酸鹽，無(wú)法清洗腸道，加上免疫系統(tǒng)受抑制、肝腸軸功能受損等一系列病理改變均可導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，造成腸道菌群和脂多糖（LPS）移位，而腸道菌群失調(diào)可進(jìn)一步加重膽汁淤積，膽汁淤積與腸道菌群失調(diào)可互為因果［4］。有臨床研究發(fā)現(xiàn)膽汁淤積性肝病患兒大腸埃希菌數(shù)量較健康嬰兒升高，而雙歧桿菌、乳酸菌數(shù)量則低于健康嬰兒［5］。但在實(shí)驗(yàn)研究方面，目前仍缺乏針對(duì)ANIT誘發(fā)的肝內(nèi)膽汁淤積模型發(fā)病過(guò)程中腸道菌群變化的相關(guān)研究，這可能與該造模方法疾病高峰出現(xiàn)較早且為自限性，而許多腸道微生態(tài)研究需要一個(gè)亞急性或慢性發(fā)病模型相關(guān)。近年來(lái)歐巧群等［6］改良了上述模型，其使用ANIT間歇性多次減量灌胃成功建立了大鼠亞急性肝內(nèi)膽汁淤積模型，其在用藥4周內(nèi)均維持了明顯的肝內(nèi)膽汁淤積，并出現(xiàn)了早期肝纖維化表現(xiàn)，這給ANIT法模型的腸道菌群研究創(chuàng)造了條件。本次研究參考以上經(jīng)驗(yàn)，在ANIT減量灌胃1次/周后，生化檢測(cè)提示23d內(nèi)大鼠肝內(nèi)膽汁淤積狀態(tài)穩(wěn)定持續(xù)，表明該法確能較好地建立亞急性肝內(nèi)膽汁淤積大鼠模型。本實(shí)驗(yàn)16s rRNA高通量測(cè)序結(jié)果表明，ANIT干預(yù)后可使大鼠門、綱、科各水平腸道菌群的豐度明顯降低，但對(duì)菌群的多樣性影響相對(duì)較小，通過(guò)進(jìn)一步對(duì)門、綱、科各水平的腸道菌群相對(duì)豐度分析顯示模型組及正常組差異主要是在變形菌門內(nèi)部結(jié)構(gòu)比例上：模型組腸道中δ-變形菌綱中的脫硫弧菌科比例較正常組明顯下降（P＜0.05），而ε-變形菌綱中的螺桿菌科比例較正常組則明顯升高（P＜0.01）。變形菌門雖然在健康人群腸道和糞便中所占的比例較低，但其包含了諸多的病原菌和機(jī)會(huì)致病菌，該分類下的細(xì)菌多為革蘭陰性桿菌，具有產(chǎn)生脂多糖的能力，膽汁淤積發(fā)生時(shí)，部分細(xì)菌在患者腸道中過(guò)度增殖可能導(dǎo)致腸黏膜炎癥并增加腸屏障功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)，從而進(jìn)一步阻礙膽汁酸的腸肝循環(huán)加重膽汁淤積，形成惡性循環(huán)。故作者推測(cè)，腸道菌群豐度的明顯下降以及腸道內(nèi)變形菌門中脫硫弧菌和螺桿菌的相對(duì)豐度變化可能是ANIT誘發(fā)的大鼠肝內(nèi)膽汁淤積的重要特征性變化。希望這一結(jié)果能為肝內(nèi)膽汁淤積的腸道微生態(tài)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供必要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及理論依據(jù)，并有助于在今后開(kāi)展進(jìn)一步的深入研究。