何 悅，王四旺，肖會敏,3

(1.陜西康城藥業(yè)股份有限公司,陜西 商洛726000；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)中藥和天然藥物學(xué)教研室，陜西 西安 710032；3.陜西含光生物科技有限公司，陜西 西安 710032)

復(fù)方金銀花顆粒由金銀花、黃芩、連翹三味中藥組成，具有清熱解毒，涼血消腫之功效，用于風(fēng)熱感冒、咽炎、扁桃體炎、目痛、牙痛及癰腫瘡癤等。方中金銀花主要活性成分含有新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸等，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化等作用[1-7]。連翹所含有效成分連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷等，具有抗菌、抗病毒等作用[8-11]。黃芩主要有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等，具有抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、心血管保護(hù)、降血糖等作用[12-21]。本處方由水提及醇沉等工藝制成。為分析該方中的功效成分，經(jīng)文獻(xiàn)檢索未發(fā)現(xiàn)采用HPLC法同時測定制劑中10個成分即新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、連翹酯苷B、連翹酯苷A、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的研究報道，現(xiàn)報告如下。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀(型號Prominence UFLC，配有SPD-M20A二極管陣列檢測器，LC/Labsoluion色譜工作站，日本島津公司)；十萬分之一電子分析天平(型號MS105DU，梅特勒公司)；KQ-100DA臺式數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。乙腈、甲醇(色譜級，美國Fisher公司)；水為自制超純水；其余為分析純。綠原酸(批號：110753-201716，純度99.3%)、咖啡酸(批號：110885-201703，純度99.7%)、連翹酯苷A(批號：111810-201606，純度93.4%)、連翹酯苷B(批號：111811-201603，純度96.6%)、黃芩苷(批號：110715-201720，純度93.5%)、漢黃芩苷(批號：112002-201702，純度98.5%)、黃芩素(批號：111595-201306，純度97.8%)等對照品均購自中國藥品生物制品檢定研究院；新綠原酸(批號：MUST-10091501，純度98.0%)、隱綠原酸(純度98.0%)、漢黃芩素(批號：B20489，純度98.0%)等購自上海源葉生物科技有限公司；復(fù)方金銀花顆粒(規(guī)格：10 g×10 袋/盒，批號：1804503～1804512，哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫，0～18 min， 5% A→20%A；18～42 min， 20% A→35%A；42～75 min， 35% A→50%A；75～90 min， 50% A →100 %A。記錄時間為90 min。體積流量：0.8 ml/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：320 nm；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 混合對照品溶液的配制

分別精密稱取新綠原酸6.94 mg、綠原酸4.83 mg、隱綠原酸4.16 mg、咖啡酸10.03 mg、連翹酯苷B 13.91 mg、連翹酯苷A 17.98 mg、黃芩苷10.42 mg、漢黃芩苷7.12 mg、黃芩素4.99 mg、漢黃芩素5.18 mg置于20 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得混合對照溶液，作為儲備液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品3袋內(nèi)容物，研細(xì)，混勻，取10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇50 ml 溶解，稱定重量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定重量，用50%的甲醇補(bǔ)足其減失的重量，搖勻，0.22 μm 的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液得到供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系的考察

分別精密量取混合對照溶液0.06、0.08、0.10、0.20、0.40 ml和2.00 ml置于各個2 ml量瓶中，分別加甲醇定容，混勻，即得系列混合對照溶液1、2、3、4、5、6。用0.45 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣。以各對照品的濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。線性方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)r2見表1。結(jié)果表明，10種對照品在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 對照品的線性方程、濃度范圍及相關(guān)系數(shù)

2.5 專屬性試驗

分別精密量取混合對照溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μl進(jìn)樣，分別記錄色譜圖。實驗結(jié)果見圖1，結(jié)果表明陰性對照無干擾，方法專屬性強(qiáng)。

圖1 混合對照品、供試品、陰性對照HPLC圖 A.混合對照品；B.復(fù)方金銀花顆粒；C.金銀花陰性對照；D.連翹陰性對照；E.黃芩陰性對照1.新綠原酸；2.綠原酸；3.隱綠原酸；4.咖啡酸；5.連翹酯苷A；6.連翹酯苷B；7.黃芩苷；8.漢黃芩苷；9.黃芩素；10.漢黃芩素

2.6 精密度試驗

精密吸取上述混合對照溶液5，重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、連翹酯苷A、連翹酯苷B、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD分別為1.07%、1.01%、1.02%、1.07%、0.99%、0.72%、0.85%、1.02%、0.91%和0.85%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密吸取上述混合對照溶液5，在第0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣。結(jié)果表明，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、連翹酯苷B、連翹酯苷A、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的峰面積的RSD分別為1.12%、1.00%、1.17%、1.02%、1.34%、1.24%、1.19%、1.15%、1.15%和1.35%，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

精密稱取樣品(批號：1804503)6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品，按“2.1”項下條件測定。測得平均含量與RSD值結(jié)果見表2，表明該方法重復(fù)性良好。

表2 復(fù)方金銀花顆粒中10種成分含量重復(fù)性試驗(mg/g)

2.9 加樣回收率試驗

取本品(批號：1804503)3袋內(nèi)容物，研細(xì)，混勻，取10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，添加混合對照品溶液(稱取對照品適量，配成每1 ml甲醇中含新綠原酸0.570 mg、綠原酸1.151 mg、隱綠原酸1.075 mg、咖啡酸0.085 mg、連翹酯苷B 0.467 mg、連翹酯苷A 0.740 mg、黃芩苷1.960 mg、漢黃芩苷0.350 mg、黃芩素0.250 mg、漢黃芩素0.260 mg的混合對照品溶液)8 ml、10 ml或12 ml，再按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件測定，重復(fù)制樣6份，結(jié)果見表3，表明該方法回收率良好。

表3 復(fù)方金銀花顆粒加樣回收率試驗(n=6)

(續(xù)表3)

2.10含量測定

精密稱取10批樣品，分別按“2.3”項下方法制備供試品，按“2.1”項下條件測定。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、翹酯苷B、連翹酯苷A、連黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的平均含量(mg/g，10 g/袋)見表4。

表4 復(fù)方金銀花顆粒中10種成分含量測定結(jié)果(mg/g)

3 分析與討論

3.1 波長的選擇

使用二極管陳列檢測器對復(fù)方金銀花顆粒樣品進(jìn)行全波長掃描，主要依據(jù)每個化合物的最大吸光值與分離度，確定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、連翹酯苷A、連翹酯苷B、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的共同檢測波長為320 nm。

3.2 色譜條件的選擇

采用梯度洗脫，曾選擇不同品牌的反相C18色譜柱，如Intersil C18、Kromasil C18、Ultimate?XB C18等進(jìn)行比較，選擇不同規(guī)格如(150 mm ×4.6 mm,5 μm)、(250 mm×4.6 mm,5 μm)等進(jìn)行比較，選擇不同流動相系統(tǒng)如乙腈-磷酸水溶液、甲醇-水、乙腈-水、乙腈-醋酸水溶液等，結(jié)果采用Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)與流動相系統(tǒng)乙腈-0.1%磷酸水溶液，結(jié)果分離度較好，故將此條件作為檢測色譜條件。

3.3 供試品制備方法

參照文獻(xiàn)[22]，同時對供試品的制備方法進(jìn)行考察，如溶劑選擇(甲醇、水、不同濃度的甲醇)、提取方法(超聲及超聲時間、加熱回流)等，由于加熱回流提取與超聲提取比較，未見更多色譜峰信息，而超聲提取時間短且色譜信息豐富。綜合上述各因素，選擇50%甲醇超聲30 min提取，得到較理想的色譜峰信息(如峰面積大、分離度好等)。

3.4 成分含量

10批制劑中10種成分含量差異較小，說明各種成分均一性較好，生產(chǎn)工藝流程相對穩(wěn)定。但本試驗未進(jìn)行不同廠家制劑含量的比較，將在以后試驗中比較并進(jìn)一步探討入血成分及組織分布。

綜上所述，本試驗建立了復(fù)方金銀花顆粒的10種成分HPLC含量測定方法，該方法操作簡單、易于實施，準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好，同時為規(guī)范和優(yōu)化本品的生產(chǎn)工藝，保證質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性，達(dá)到用藥安全、穩(wěn)定的目的提供了理論依據(jù)，因此該方法可作為評價復(fù)方金銀花顆粒質(zhì)量的有效方法之一。