王學(xué)雷，晁玉凡，高松燕，董 昕，溫曉飛

(1.上海東方醫(yī)院泌尿外科，上海 200120；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院測試中心，上海 200433)

進(jìn)入21世紀(jì)以來，泌尿系結(jié)石的患病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)高發(fā)態(tài)勢，并且伴隨全球氣候變暖、人們生活習(xí)慣和飲食的變化等，發(fā)病率在繼續(xù)上升[1-2]。最新研究顯示，中國的男性腎結(jié)石患病率為6.5%，女性為5.1%[3]。腎結(jié)石病程較長且病程反復(fù)，在首次發(fā)病后，有50% 的患者可能會在7年內(nèi)再次發(fā)病[4]。并且腎結(jié)石可增加發(fā)生慢性腎病以及終末期腎病的概率[5-6]。

草酸鈣結(jié)石約占腎結(jié)石的80%[7]，目前對草酸鈣結(jié)石的研究認(rèn)為腎小管上皮細(xì)胞的損傷對草酸鈣結(jié)石的形成至關(guān)重要[8]，而細(xì)胞內(nèi)的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)直接參與損傷的過程[9-10]。由于缺乏對疾病整體動態(tài)的認(rèn)識，草酸鈣結(jié)晶導(dǎo)致腎損傷的機(jī)制仍未明確。流行病學(xué)研究表明，代謝綜合征患者有較高的結(jié)石患病率[11]，且機(jī)體代謝紊亂在結(jié)石的形成過程中發(fā)揮重要作用[12]，因此對草酸鈣結(jié)石進(jìn)行系統(tǒng)性的代謝評價(jià)有利于疾病的發(fā)病機(jī)制研究以及早期診斷和個(gè)性化防治[1]。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白組學(xué)之后系統(tǒng)生物學(xué)的重要分支，旨在對反映生物體狀態(tài)變化的內(nèi)源性代謝物群體進(jìn)行全面的監(jiān)測和研究[13-14]，可以為草酸鈣結(jié)石引起的腎損傷的系統(tǒng)性代謝變化研究提供一個(gè)有力工具。

尿液中草酸鹽含量的升高是草酸鈣結(jié)石形成的重要因素。目前，乙醛酸鹽作為草酸鹽的前體被用于誘導(dǎo)草酸鈣結(jié)石模型[15]。本研究以UPLC-Q-TOF/MS的代謝組學(xué)方法為主要研究手段，以常規(guī)組織生化分析為輔助，使用乙醛酸鹽誘導(dǎo)的小鼠草酸鈣結(jié)晶模型對草酸鈣結(jié)晶造成的腎損傷過程中尿液內(nèi)源性代謝物的變化情況進(jìn)行系統(tǒng)研究，為疾病的形成機(jī)制研究以及早期生物標(biāo)志物的篩選提供方向。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

色譜級甲醇、乙腈(Merck,Germany)。HPLC級甲酸(Fluka,Switzerland)。乙醛酸(TCI,Japan)，加入NaOH調(diào)至pH7.4配成乙醛酸鹽。超純水由Milli-Q水凈化系統(tǒng) (Millipore Corp.,USA)制備得到。色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、牛磺酸、尿酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma-Aldrich,USA)。

1.2 乙醛酸鹽誘導(dǎo)的小鼠結(jié)晶腎損傷模型的建立[16]

18只7～8周齡C57B/L6雄性小鼠購自上海斯萊克斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司。經(jīng)過1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，將小鼠隨機(jī)分為3組，對照組(U0)、模型1 d組(U1)和模型5 d組(U5)，每組6只。模型組每天腹腔注射100 mg/kg的乙醛酸鹽造模，對照組每天腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 生物樣本的采集[16]

對照組和模型組在最后一次注射后，置于代謝籠中收集24 h尿液(正常飲水，禁食)，4 000 r/min離心5 min后，取上清液。眼眶取血，室溫靜置1 h后，3 500 r/min，4℃離心15 min，取血清。所有離心后尿樣和血清于-80 ℃凍存。行心臟灌流后，采集腎臟，置于4%多聚甲醛中固定。

1.4 動物模型評價(jià)

測定各組血清中肌酐和尿素氮含量。將固定后的腎組織用石蠟包埋，切成3～4 μm的薄片，采用馮庫薩試劑盒(杰美基因，上海)進(jìn)行染色。在400倍放大倍數(shù)下，觀察腎組織鈣沉積情況。

1.5 樣品的制備

將尿液在4 ℃解凍后，取100 μl尿樣，加入300 μl甲醇進(jìn)行蛋白沉淀和代謝物提取。渦旋5 min，將樣品置于4 ℃靜置10 min，于13 000 r/min、4 ℃離心10 min。取150 μl上清液于進(jìn)樣小瓶中待分析。此外，每個(gè)樣本各取50 μl上清液混合成質(zhì)控樣本(quality control,QC)，用于考察系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

1.6 尿樣的UPLC-Q-TOF /MS分析

UPLC-Q-TOF/MS分析使用安捷倫1290 Infinity 液相系統(tǒng)和安捷倫6538 高分辨單四級桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 (Agilent,USA) 。色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm,Waters)，柱溫40 ℃。流動相為0.1%甲酸(A)-含0.1%甲酸的乙腈(B)。優(yōu)化后的梯度條件：0～2 min,5% B; 2～10 min,5%～15% B; 10～14 min,15%～30% B; 14～17 min,30%～95% B; 17～19 min,95% B。流速：0.4 ml/min，進(jìn)樣量：3 μl，自動進(jìn)樣器溫度：4 ℃。

質(zhì)譜使用電噴霧離子源(ESI)采集正、負(fù)離子數(shù)據(jù)。為了監(jiān)測及考察系統(tǒng)的穩(wěn)定性，在尿液的正、負(fù)離子模式下分別隨機(jī)插入6針QC。通過無監(jiān)督的主成分分析(PCA)中QC的聚集程度考察系統(tǒng)的穩(wěn)定性。同時(shí)，計(jì)算每個(gè)離子在QC樣品中的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，%)，如RSD大于20%認(rèn)為變異較大，其顯著性的差異可能是由于偶然相關(guān)造成的[17]。

1.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用R軟件平臺，調(diào)用XCMS程序包，進(jìn)行峰的識別、校正和積分。將變量根據(jù)80%原則篩選去除噪音信號[18]和面積歸一化后，導(dǎo)入到SIMCA-P 11.0 (Umetrics,Sweden)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。采用無監(jiān)督的PCA分析表征樣本組間的分離趨勢以及觀測離群值[19]，用得分圖表征結(jié)果。采用有監(jiān)督的偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)進(jìn)行差異物質(zhì)的篩選，用得分圖和S-Plot圖表征結(jié)果。S-Plot圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)變量，離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的變量，其可能對組間差異的貢獻(xiàn)率越大，則VIP(variance importance)值就越大[20]。并根據(jù)R2、Q2值以及排列測試的結(jié)果對模型進(jìn)行驗(yàn)證[21]，R2表示數(shù)據(jù)模型在某方向上可以解釋的變量與總變量的比值，Q2表示模型的預(yù)測能力[22]。將VIP值大于1的變量作為顯著差異物質(zhì)的候選變量。

1.8 差異代謝物的鑒別[23]

首先，利用在線網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫如Metlin(http://metlin.scripps.edu/),Human Metabolome Database (http://www.hmdb.ca/)進(jìn)行匹配，以及利用MassHunter定性軟件對精確m/z值進(jìn)行分子式匹配，對離子進(jìn)行推斷性鑒別；然后，進(jìn)行MS/MS分析，對采集的MS/MS碎片與Metlin數(shù)據(jù)庫中的碎片信息進(jìn)行比對以確定代謝物；對于易得到標(biāo)準(zhǔn)品的代謝物，將其保留時(shí)間以及MS/MS碎片信息與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對，最終確證代謝物。

2 結(jié)果與討論

2.1 腎鈣含量測定

馮庫薩染色(圖1)顯示，對照組的腎臟中未出現(xiàn)鈣沉積，模型組的腎小管腔及間質(zhì)中均可見大量的黑色鈣鹽沉積，腎小管腔明顯擴(kuò)大。且U5組的鈣鹽沉積情況比U1組更明顯。

2.2 血清生化指標(biāo)分析

如圖2所示，與U0組相比，U5組中血肌酐(P<0.05)、尿素氮(P<0.001)的含量均顯著升高，且U5組尿素氮的含量比U1組明顯上升(P<0.05)，表明模型組出現(xiàn)了一定的腎損傷。

圖1腎臟組織的馮庫薩染色圖(×400) A.U0組；B.U1組；C.U5組

圖2 血清中的肌酐和尿素氮含量 A.肌酐含量；B.尿素氮含量*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與U0組比較；#P<0.05，與 U1組比較

2.3 尿液代謝組學(xué)輪廓分析與差異代謝物的篩選

UPLC-Q-TOF/MS采用正、負(fù)兩種模式對尿液進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，兩種模式下典型的總離子流圖(TIC)見圖3，色譜峰分布均勻。如圖4所示，正、負(fù)離子模式下，QC的聚集狀況均良好，表明系統(tǒng)的穩(wěn)定性良好。U0組、U1組和U5組的PCA得分如圖5 A、5B所示，U5與U0組分離趨勢顯著，U1與U0組分離趨勢不明顯。同時(shí)，筆者使用Metaboanalyst軟件將3組數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，從圖 5 C、5D可以看出，U1組的個(gè)體差異較大，不能與U0很好的區(qū)分。因此，對U5與U0組尿液進(jìn)行有監(jiān)督的PLS-DA分析，篩選乙醛酸鹽誘導(dǎo)的結(jié)晶腎損傷的差異代謝物。根據(jù)R2、Q2值以及排列測試對PLS-DA模型進(jìn)行驗(yàn)證。PLS-DA得分和S-Plot見圖6 A-D所示，正、負(fù)離子模式下U0和U5組明顯分離。正模式下，R2Y=0.98，Q2=0.708；負(fù)模式下，R2Y=0.992，Q2=0.786；排列測試圖如圖6 E、6F所示，模型均良好，未出現(xiàn)擬合現(xiàn)象。筆者結(jié)合VIP值和離子在組間的變化倍數(shù)(fold change,FC)篩選差異物質(zhì)。VIP >1且|FC|>1.5的離子認(rèn)為是U0和U5組的顯著差異離子，同時(shí)剔除在QC樣本中RSD (%) 值大于20的離子。經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，認(rèn)為P<0.05的變量是乙醛酸鹽誘導(dǎo)的結(jié)晶腎損傷尿液中潛在的生物標(biāo)志物。

圖3 尿液正、負(fù)離子模式下典型的總離子流圖 A.正離子模式下；B.負(fù)離子模式下

圖4 3組尿樣及QC樣品正、負(fù)離子模式下的主成分分析得分圖 1.正離子模式下；B.負(fù)離子模式下

對差異代謝物進(jìn)行鑒別，最終從尿液中鑒別出21個(gè)差異代謝物，見表1。

表1 乙醛酸鹽誘導(dǎo)的結(jié)晶腎損傷小鼠尿液差異代謝物列表

注：“—”表示缺失碎片離子

如表1所示，與對照組(U0)相比，模型組(U1、U5)尿液中代謝物有11種顯著下調(diào)，10種顯著上調(diào)。其中，三甲基賴氨酸、尿酸、蘇氨酸、苯乳酸、?；撬?、4-吡哆酸顯著下調(diào)；琥珀酸、賴氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、氧代壬酸和脂肪?；拾彼犸@著上調(diào)。為了直觀地展現(xiàn)差異物質(zhì)在3組中的變化趨勢，筆者使用Metaboanalyst軟件(http://www.metaboanalyst.ca)繪制熱圖(圖7)。

3 討論

對篩選出的21種差異代謝物建立代謝相關(guān)網(wǎng)絡(luò) (圖8)，涉及的通路有氨基酸代謝、能量代謝、牛磺酸代謝、次牛磺酸代謝、 VB代謝和嘌呤代謝等。

模型組尿液中芳香族氨基酸(AAA)苯丙氨酸和色氨酸明顯升高，表明在結(jié)晶腎損傷過程中AAA代謝受到干擾，這與腎臟疾病跟AAA降解、合成或排泄密切相關(guān)[24-25]。?；撬崾遣溉閯游锛?xì)胞中一種重要的含硫β-氨基酸[26]，被認(rèn)為是一種內(nèi)源性抗氧化劑和膜穩(wěn)定劑。許多研究已經(jīng)證明?；撬釋Χ喾N類型腎損傷的保護(hù)作用，包括缺血/再灌注損傷、高血糖、氧化應(yīng)激和外源性物質(zhì)造成的損傷[27]。而模型組中?；撬犸@著下降，表明牛磺酸和次?；撬岽x在結(jié)晶損傷過程中受到干擾。

脂肪酰甘氨酸作為脂肪酸的代謝產(chǎn)物，由乙酰輔酶A(acyl-CoA)與甘氨酸在線粒體酶甘氨酸N-?；D(zhuǎn)移酶(glycine N-acyltransferase)的催化作用下產(chǎn)生[28]。而在一些有機(jī)酸血癥中，由于甘氨酸N-?；D(zhuǎn)移酶的高親和力，一些acyl-CoA與甘氨酸的結(jié)合優(yōu)于與卡尼汀的結(jié)合[29]，從而影響線粒體內(nèi)脂肪酸的β氧化[30-32]。本研究中，模型組尿液中的乙烯乙酰甘氨酸顯著上升，表明乙醛酸鹽誘導(dǎo)的結(jié)晶腎損傷過程中脂肪酸β氧化可能出現(xiàn)障礙，而脂肪酸β氧化異常會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和氧自由基的產(chǎn)生，這也與ROS的累積與腎小管細(xì)胞的損傷以及鈣鹽的附著有重要關(guān)系結(jié)論[33-35]相一致。

圖7 尿液中21種差異物質(zhì)聚類分析熱圖 注：紅色越深代表量越高，綠色越深代表量越低

圖8 乙醛酸鹽誘導(dǎo)的小鼠結(jié)晶腎損傷尿液顯著差異代謝物代謝網(wǎng)絡(luò)圖 注：紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)

4-吡哆酸是VB6的重要代謝產(chǎn)物，VB6轉(zhuǎn)化成4-吡哆酸后排出體外。VB6可以通過減少草酸的內(nèi)源性合成抑制草酸鈣結(jié)晶的形成，多項(xiàng)研究表明補(bǔ)充VB6可以減少尿液中草酸的排泄[36-39]。內(nèi)源性草酸可以經(jīng)甘氨酸-乙醛酸-草酸[40]途徑合成。VB6是氨基酸代謝中轉(zhuǎn)氨酶的輔酶[38]，大量VB6存在時(shí)，乙醛酸可以在丙氨酸乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine glyoxylate aminotransferase，AGT)催化下氨基化，轉(zhuǎn)化成甘氨酸，減少草酸的生成，而乙醛酸的上游代謝物乙醇酸也會轉(zhuǎn)化為VB6。本研究中，小鼠給予乙醛酸后，4-吡哆酸的含量在尿液中顯著下降，表明存在大量乙醛酸時(shí)干擾VB6的代謝。

尿酸是嘌呤代謝中的重要物質(zhì)，在機(jī)體內(nèi)，次黃嘌呤可以被代謝為黃嘌呤，而黃嘌呤可以被繼續(xù)代謝為尿酸。本研究中，模型組尿樣中尿酸的含量下降表示尿酸經(jīng)腎臟的排泄發(fā)生障礙。作為嘌呤代謝的重要下游產(chǎn)物，尿酸對腎臟疾病的影響存在很大爭議。有報(bào)道稱尿酸對慢性腎臟病(CDK)的進(jìn)展是一個(gè)潛在的重要風(fēng)險(xiǎn)因素，也有一些研究表明，可溶性尿酸作為一種強(qiáng)大的抗氧化劑，可以發(fā)揮其保護(hù)作用[41-43]。雖然尿酸的作用在本文中無法很好的闡述，但可以說明在此模型結(jié)晶形成過程中嘌呤代謝受到了強(qiáng)烈干擾，給繼續(xù)研究其機(jī)制以及標(biāo)志物的篩選提供了重要參考。

本研究中，課題組利用乙醛酸鹽誘導(dǎo)的小鼠結(jié)晶腎損傷模型，采用基于UPLC-Q-TOF/MS的代謝組學(xué)方法從尿液中篩選出21個(gè)差異代謝物，主要涉及氨基酸代謝、能量代謝、牛磺酸和次?；撬岽x、嘌呤代謝和VB6代謝，為疾病機(jī)制研究以及早期標(biāo)志物的篩選提供了重要參考，但要闡明疾病的具體機(jī)制可能還需要結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。