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(1.湖南道縣師范學(xué)校,湖南永州 425300; 2.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100029)

卵磷脂是動物和植物體內(nèi)一種非常重要的含磷物質(zhì),主要包括磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇和磷脂酰絲氨酸等成分[1]。狹義而言,卵磷脂通常是指磷脂酰膽堿。磷脂酰膽堿由親水性的頭部和疏水性的尾部組成,是一種良好的食品乳化劑。研究表明,卵磷脂具有良好的生理特性,如抗氧化活性[2];提高大腦的活性和加強(qiáng)記憶力[3];降低血脂,減少脂質(zhì)在血管內(nèi)壁的停留時間,降低膽固醇[4]等。因此,卵磷脂在食品、化妝品以及醫(yī)藥等領(lǐng)域都有應(yīng)用[5-6]。

卵磷脂來源十分廣泛,如:蛋黃、牛奶、動物組織、大豆、玉米和油菜籽。目前,主要從大豆和蛋黃中提取卵磷脂,提取方法分為超臨界CO2[7-8]和有機(jī)溶劑提取法[9-10]。上述方法均存在各自的優(yōu)勢和劣勢,如超臨界CO2萃取卵磷脂時,雖然可以避免高溫和溶劑對產(chǎn)品特性的影響,但是設(shè)備昂貴,成本高;有機(jī)溶劑提取法成本相對較低,但是提取效率不高。超聲提取法利用超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)等,加速胞內(nèi)有效物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解,顯著提高提取效率,廣泛應(yīng)用于卵磷脂的提取[11-13]。因此,耦合溶劑提取和超聲提取的各自優(yōu)勢,采用超聲輔助有機(jī)溶劑提取卵磷脂,將大幅提升提取效率,節(jié)約提取時間。

研究表明[14-15],超聲輔助提取卵磷脂的主要影響因素包括:液料比、有機(jī)溶劑濃度和提取時間,因此,本文以蛋黃為原料,采用響應(yīng)面方法,優(yōu)化卵磷脂提取的上述3個主要影響因素,并采用薄層色譜、紅外和氣-質(zhì)等,分析所獲得的蛋黃卵磷酯結(jié)構(gòu)特性和脂肪酸組成;同時,以大豆卵磷脂為參照,分析了蛋黃卵磷脂的穩(wěn)定性和抗氧化活性,以期為蛋黃卵磷脂的綜合利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫油蛋黃粉 北京卵磷脂生物技術(shù)有限公司提供;磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;菜籽油和大豆油 北京華聯(lián)超市;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(BHT)、無水乙醇、氯仿、甲醇、碘、氫氧化鉀、三氟化硼乙醚、正己烷、氯化鈉、氧化鋅、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等 均為國產(chǎn)分析純。

SB-5200超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;UV-756CRT型紫外分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司;VERTEX 70v紅外光譜儀 德國Bruker公司;Trace ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 Thermo Fisher公司;RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器有限公司。

1.2 蛋黃粉卵磷脂的提取與含量測定

1.2.1 超聲輔助提取卵磷脂工藝流程

圖1 卵磷脂提取工藝流程Fig.1 Process of lecithin extraction

1.2.2 工藝參數(shù)優(yōu)化 研究表明,影響卵磷脂提取工藝參數(shù),主要包括:液料比、乙醇濃度和提取時間[13-15]。為了獲得最適提取工藝條件,采用響應(yīng)面方法,以卵磷脂含量為指標(biāo),優(yōu)化上述參數(shù),因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.3 卵磷脂含量測定 采用鉬藍(lán)比色法(AOCS Official Method Ca 12-55)檢測提取物中卵磷脂含量,用紫外分光光度計(jì)測定鉬藍(lán)的吸光度[16]。具體步驟:稱取0.5 g卵磷脂提取物與坩堝中,加入0.5 g的氧化鋅,于酒精燈上加熱至全部炭化。再將其放入馬弗爐中進(jìn)行完全灰化,加入10 mL的1∶1鹽酸溶液,加熱到微沸,加熱時間為5 min,然后將其過濾于50 mL錐形瓶中,用5 mL的熱水沖洗坩堝3次,將洗液完全轉(zhuǎn)移至錐形瓶中,加入50%氫氧化鉀溶液中和至出現(xiàn)渾濁,再加入1∶1鹽酸溶液使沉淀溶解,再加兩滴。最后用水稀釋至100 mL。取10 mL的待測液,加入8 mL的0.015%硫酸聯(lián)氨溶液,2 mL 2.5%鉬酸鈉溶液。充分搖勻,放在沸水浴中加熱10 min,然后冷卻至室溫。再加入5 mL的去離子水,靜置10 min后,用分光光度計(jì)在650 nm處測定吸光度。對比磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.475x+0.0016,R2=0.999),按以下公式計(jì)算卵磷脂含量。

卵磷脂含量計(jì)算公式:

C(mg/g)=(P/m)×(V1/V2)×26.31

式(1)

式中:C:卵磷脂含量,mg/g;P:標(biāo)準(zhǔn)曲線所對應(yīng)的磷含量,mg;m:卵磷脂提取物樣品的質(zhì)量,g;V1:樣品灰化后稀釋的體積,mL;V2:檢測時所取得待測液體的體積,mL。

1.3 蛋黃卵磷酯的結(jié)構(gòu)特性

1.3.1 卵磷脂薄層色譜(TLC)分析 分別準(zhǔn)確稱取10 mg的磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品和卵磷脂提取物溶解在1 mL甲醇中,用毛細(xì)管將樣品點(diǎn)樣于25 mm×75 mm薄層板上,置于裝有氯仿/甲醇/水(65∶25∶4,v/v/v)的層析缸內(nèi)展開,用碘蒸氣進(jìn)行顯色[17]。

1.3.2 卵磷脂紅外光譜(FT-IR)分析 將卵磷脂提取物和磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品,分別和KBr進(jìn)行壓片制樣,采用VERTEX 70v紅外光譜儀進(jìn)行測定。

1.3.3 氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)檢測卵磷脂提取物脂肪酸組成 甲酯化:準(zhǔn)確稱取50 mg的卵磷脂提取物加入2 mL 0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液,在60 ℃下反應(yīng)30 min,加入2 mL的三氟化硼乙醚溶液反應(yīng)20 min,冷卻后加入2 mL的正己烷溶液,最后加入2 mL飽和氯化鈉溶液。取上層正己烷相,加入少量無水硫酸鈉,5000 r/min離心5 min,取上清過0.22 μm濾膜,進(jìn)行GC-MS分析[18]。

分析條件:GC-MS:Trace ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,色譜柱:TG-WAXMS毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。進(jìn)樣口溫度為320 ℃,載氣為氦氣,流速為1 mL/min。升溫程序:柱溫50 ℃,保持1 min,25 ℃/min升溫到200 ℃,3 ℃/min升溫到230 ℃,保持15 min。離子源溫度為280 ℃。電離方式EI,掃描模式為Scan,掃描范圍為:35～550 amu。

1.4 蛋黃卵磷脂的穩(wěn)定性與抗氧化研究

1.4.1 穩(wěn)定性研究

1.4.1.1 溫度對卵磷脂穩(wěn)定性的影響 取適量蛋黃卵磷脂,在-4、4 ℃、室溫(25 ℃)下進(jìn)行密封避光貯藏,時間為15 d,測定酸值和抗氧化值。以磷脂酰膽堿標(biāo)品作為對照。

酸值測定參照GB/T 5530-2005[19]?？寡趸瘻y定參考文獻(xiàn)[20]:取適量蛋黃卵磷脂和大豆卵磷脂用無水乙醇溶解,分別取1.5 mL加入到1.5 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液中,室溫下反應(yīng)30 min,在517 nm處用紫外分光光度計(jì)測定吸光度,計(jì)算清除率。

清除率(%)=(1-A1/A0)×100

式(2)

式中:A1:加提取液后DPPH溶液的吸光度;A0:空白對照DPPH溶液的吸光度。

1.4.1.2 光照對卵磷脂穩(wěn)定性的影響 取適量的蛋黃卵磷脂和大豆卵磷脂,分別在光照和避光的條件下密封貯藏,溫度為4 ℃,在第5、8、12 d時測定酸值和抗氧化值。酸值和抗氧化值測定方法同上。

1.4.2 抗氧化研究

1.4.2.1 卵磷脂對油脂的抗氧化分析 將5 mg/mL的蛋黃卵磷脂和大豆卵磷脂加入到大豆油和菜籽油中,進(jìn)行加速氧化,溫度為90 ℃,孵育5 h,測定大豆油和菜籽油的酸值和過氧化值。以相同濃度的抗壞血酸(VC)為陽性對照,以不加任何抗氧化劑,即空白實(shí)驗(yàn)作陰性對照。酸值測定參照GB/T 5530-2005[19]。過氧化值測定參照GB/T 5538-2005[21]。

1.4.2.2 卵磷脂還原力測定 分別取1、2、3、4、5 mg/mL的蛋黃卵磷脂和大豆卵磷脂溶液各0.5 mL,加入2.5 mL pH6.6磷酸緩沖溶液,0.5 mL去離子水,再加入1%鐵氰化鉀1 mL,混合物在50 ℃恒溫條件下,加熱20 min,急速冷卻,加2.5 mL 10%三氯乙酸,3500 r/min離心分離10 min。取上層清液2.5 mL,加入2.5 mL去離子水,再加0.5 mL 0.1%三氯化鐵,混合均勻,靜置10 min后,以蒸餾水為參比在700 nm波長處測定吸光度[20]。

按照同樣的操作步驟,以BHT為陽性對照,BHT的濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 8.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),每個實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次,取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化蛋黃卵磷脂提取工藝

2.1.1 模型建立與顯著性檢驗(yàn) 根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用Design-Expert 8.0軟件,以液料比、乙醇濃度和提取時間為自變量,卵磷脂含量為響應(yīng)值。按表1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共進(jìn)行17組實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表2。對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸,得到回歸方程如下:

表2 卵磷脂提取工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)及結(jié)果Table 2 RSM design and experimental results

Y(mg/g)=382.52-2.5X1+17.45X2+9.62X3+10.71X1X2-0.37X1X3-3.02X2X3-36.01X1X1-64.69X2X2-24.69X3X3

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 The main effective ANOVA

2.1.2 響應(yīng)曲面分析與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 不同因素對卵磷脂含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖,見圖2。從響應(yīng)面的最高點(diǎn)可以看出,實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)存在極值。圖2A表示了料液比和提取時間對蛋黃卵磷脂提取影響，響應(yīng)面曲線走勢陡峭，但是其等高線圖近圓形，表明上述兩因素交互影響相對來說顯著性較弱。等高線圖顯示，料液比為15 mL/g，提取時間為25 min時，卵磷脂含量可達(dá)到最大值為382.52(mg/g)。圖2B表示了乙醇濃度和提取時間對蛋黃卵磷脂提取影響，響應(yīng)面曲線走勢陡峭，等高線圖為橢圓形狀，表明上述兩因素影響顯著。等高線圖顯示，乙醇濃度為90%，提取時間為25 min時，卵磷脂含量可達(dá)到最大值為382.52(mg/g)。圖2C表示了液料比和乙醇濃度交互作用對蛋黃卵磷脂提取影響，響應(yīng)面曲線走勢陡峭，等高線圖為橢圓形狀，表明上述兩因素影響顯著。等高線圖顯示，液料比15∶1 mL/g，乙醇濃度90%時，卵磷脂含量可以達(dá)到最大值382.52(mg/g)。

通過Design-expert 8.0軟件,獲得蛋黃卵磷脂提取的最佳工藝條件:液料比15 mL/g,乙醇濃度91.28%,提取時間22 min。在此工藝條件下,卵磷脂含量(Y)達(dá)378.47 mg/g。

為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性,同時考慮到實(shí)際操作和實(shí)驗(yàn)儀器的局限性，修正后的工藝條件如下：料液比為15∶1 mL/g,乙醇溶液為92%，提取時間為22 min。在此條件下進(jìn)行了3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到卵磷脂含量的平均值為375.69 mg/g,與計(jì)算值誤差0.73%,說明模型準(zhǔn)確可靠,用于預(yù)測卵磷脂含量是可行的。

2.2 蛋黃卵磷脂結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 卵磷脂薄層色譜(TLC)分析 薄層色譜法檢測了蛋黃卵磷脂提取物的組成,結(jié)果見圖3。

圖3 磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品和卵磷脂提取物的薄層色譜圖Fig.3 Thin layer chromatography of phosphatidyl choline standard and lecithin extract 注:A. 磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品;B. 提取蛋黃卵磷脂。

從TLC圖可以看出,卵磷脂提取物的斑點(diǎn)和磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品的斑點(diǎn)Rf值相同,由此可知,提取的蛋黃卵磷脂中含有磷脂酰膽堿。Gallier等[17]研究了四種牛奶乳制品的磷脂組成,TLC結(jié)果顯示,四種乳制品中磷脂組成含有磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇和磷脂酸。因此,磷脂酰膽堿是卵磷脂主要組成成分之一。

2.2.2 卵磷脂紅外光譜(FT-IR)分析 蛋黃卵磷脂提取物和磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品FT-IR分析結(jié)果見圖4。它們具有相同的特征吸收峰:波數(shù)1089.5 cm-1左右的吸收峰為P-O-C的伸縮振動;波數(shù)967.1 cm-1的吸收峰為C-C-N彎曲振動;波數(shù)1236 cm-1的吸收峰為O-P-O伸縮振動;波數(shù)1738 cm-1的吸收峰是飽和脂肪酸羧酸酯中的C=O伸縮振動;波數(shù)2851和3008 cm-1的吸收峰分別為卵磷脂中飽和C-H和不飽和C=H伸縮振動。

圖4 磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品和卵磷脂提取物的IR圖譜Fig.4 The IR spectra of phosphatidyl choline standard and lecithin extract

2.2.3 蛋黃卵磷脂側(cè)鏈脂肪酸組成GC-MS 分析 蛋黃卵磷脂提取物進(jìn)行甲酯化處理,用GC-MS檢測脂肪酸組成,結(jié)果見圖5?？梢钥闯?蛋黃卵磷脂中脂肪酸種類主要包括軟脂酸(C16∶0)23.14%、硬脂酸(C18∶0)16.31%、油酸(C18∶1)25.35%、亞油酸(C18∶2)17.08%。飽和脂肪酸總含量為39%,不飽和脂肪酸總含量為42%。徐明明等[25]研究了蛋黃卵磷脂和蛋黃磷脂酰膽堿的脂肪酸組成與結(jié)構(gòu),結(jié)果表明,主要飽和脂肪酸組成為軟脂酸和硬脂酸,不飽和脂肪酸為油酸和亞油酸,飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例約為1∶1,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

圖5 卵磷脂的脂肪酸組成GC-MS分析Fig.5 Gas-chromatogram analysis of fatty acid composition of lecithin

2.3 蛋黃卵磷脂的穩(wěn)定性研究

2.3.1 溫度對卵磷脂穩(wěn)定性的影響 以大豆卵磷脂為對照,探討了溫度對蛋黃卵磷脂穩(wěn)定性的影響,結(jié)果見圖6。隨著溫度的升高,酸值增加,清除DPPH的能力降低,表明溫度與卵磷脂穩(wěn)定性呈一定反比相關(guān)關(guān)系。從圖中可以看出,蛋黃卵磷脂酸值升高程度和DPPH清除率降低程度要低于大豆卵磷脂,因此,蛋黃卵磷脂的溫度穩(wěn)定性優(yōu)于大豆卵磷脂。Nara等[26]研究了大豆、蛋黃以及鮭魚卵卵磷脂的氧化穩(wěn)定性,證明蛋黃卵磷脂比大豆卵磷脂穩(wěn)定性高,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是蛋黃卵磷脂比大豆卵磷脂的飽和脂肪酸含量高,因此更穩(wěn)定。

圖6 溫度對卵磷脂穩(wěn)定性的影響 Fig.6 Effect of different temperature on lecithin stability

2.3.2 光照對卵磷脂穩(wěn)定性的影響 以大豆卵磷脂為對照,研究了光照對蛋黃卵磷脂穩(wěn)定性的影響,結(jié)果見圖7。由圖可知,在光照條件下,大豆卵磷脂和蛋黃卵磷脂的酸值都要比避光保存條件下高。大豆卵磷脂和蛋黃卵磷脂清除DPPH的能力會有所降低,表明光照對于卵磷脂穩(wěn)定性有負(fù)相關(guān)影響。因此,貯存卵磷脂產(chǎn)品時,避光保存為宜。

圖7 光照對卵磷脂穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of illumination on lecithin stability

2.4 卵磷脂抗氧化性分析

卵磷脂作為一種天然抗氧化劑,添加到食用油中可以有效防止油脂氧化。將大豆和蛋黃卵磷脂分別加入到大豆油(圖A)和菜籽油(圖B)中,以加入VC作陽性對照,以空白作陰性對照,進(jìn)行加速氧化,檢測食用油的氧化程度,可以間接說明卵磷脂的抗氧化性,結(jié)果見圖8。

圖8 卵磷脂抗氧化性分析Fig.8 Antioxidant activity of lecithin 注:A為大豆油體系;B為菜籽油體系。

實(shí)驗(yàn)表明,在大豆油和菜籽油中添加卵磷脂,表現(xiàn)出對食用油脂的抗氧化保護(hù)作用,這是因?yàn)槁蚜字资艿阶杂苫墓舳缺谎趸?從而對油脂起到保護(hù)作用。其中,蛋黃卵磷脂的抗氧化效果好于大豆卵磷脂和VC。Palacios等[27]比較了蛋黃卵磷脂和大豆卵磷脂的抗氧化能力,結(jié)果顯示,蛋黃卵磷脂要優(yōu)于大豆卵磷脂,這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。然而,隨著氧化時間的延長,卵磷脂的抗氧化能力變?nèi)?油脂酸值和過氧化值呈現(xiàn)增高趨勢。Huang等[28]研究表明,VC和磷脂復(fù)配能增強(qiáng)磷脂的抗氧化效果。

2.5 卵磷脂還原力分析

研究表明,還原能力是反映抗氧化活性的一個重要指標(biāo)。因此,通過測定還原力可以體現(xiàn)物質(zhì)抗氧化能力的大小[29]。比較了蛋黃卵磷脂和大豆卵磷脂的還原力大小,以添加BHT作對照,結(jié)果見圖9。

圖9 卵磷脂還原力分析Fig.9 Reducing power of lecithin

實(shí)驗(yàn)表明,卵磷脂具有一定的還原能力,隨卵磷脂質(zhì)量濃度增加,蛋黃卵磷脂和大豆卵磷脂的還原力逐漸增強(qiáng),且蛋黃卵磷脂的還原力高于大豆卵磷脂,這與它們的抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。當(dāng)?shù)包S卵磷脂濃度為5 mg/mL時,在700 nm處的吸光值為0.213,但是,與BHT還原力相比,蛋黃卵磷脂的還原力明顯較弱,約為BHT的十分之一。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲輔助提取蛋黃卵磷脂工藝參數(shù):液料比15∶1 mL/g、乙醇濃度92%、提取時間22 min。在此工藝條件下,卵磷脂含量378.47 mg/g。平行實(shí)驗(yàn)表明,響應(yīng)回歸模型計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值相近,驗(yàn)證了模型的可靠性。TLC和FT-IR分析表明,蛋黃卵磷脂提取物主要成分為磷酯酰膽堿。GC-MS分析了蛋黃卵磷脂脂肪酸組成,飽和與不飽和脂肪酸比例較接近于1∶1。穩(wěn)定性和抗氧化分析表明,蛋黃卵磷脂具有一定的抗氧化性和穩(wěn)定性,且優(yōu)于大豆卵磷脂。高溫和光照不利于蛋黃卵磷脂的貯藏。研究結(jié)果為蛋黃卵磷脂的加工和貯藏提供了一定的參考價(jià)值。