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(1.北京林業(yè)大學經濟管理學院,北京 100083; 2.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 100176; 3.煙臺欣和味達美企業(yè)食品有限公司,山東煙臺 264006)

豆醬是我國四大傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品之一,含有人體所需的多種營養(yǎng)成分,而且由于經過微生物的發(fā)酵，更容易被人體消化吸收,還具有眾多生理調節(jié)功能,如抗癌、溶解血栓、降血壓[1]、抗氧化等,此外豆醬還具有抑制膽固醇、防止胃潰瘍的功效[2]。

現階段我國在醬制品領域的研究主要集中在以下四方面:釀造醬副產物的研究,閻杰等[3]從釀造醬渣中提取了粗脂肪,劉朝陽[4]對釀造醬渣在水產飼料行業(yè)中的應用進行了綜述;釀造醬本身的特性的研究,孫常雁等[5]研究了傳統(tǒng)釀造醬及醬油中酶系的作用,朱天傲[6]對醬制品中生物胺及產胺芽孢桿菌進行了研究;對加工過程的研究,時威等[7]對黃豆醬殺菌工藝條件進行了研究,陳波等[8]研究了歐姆加熱對大豆醬殺菌效果及營養(yǎng)成分的影響;檢測方法的研究,張偉清等[9]研究了醬油及醬制品中三氯蔗糖的測定，楊宇民[10]研究了利用容量分析法測定醬制品中的乙醇含量。以上研究均集中于產品本身及加工、產品的檢測方法及衍生物的研究,而沒有對產品在使用過程中的微生物情況進行分析和研究,忽略了產品的外在使用特性,因此本文從該角度出發(fā)進行研究,對于釀造醬產品提出微生物挑戰(zhàn)性實驗方法并進行具體應用。

目前,國內外微生物挑戰(zhàn)性試驗方法主要應用于化妝品防腐效能評價,其基本原理是在化妝品中加入一定量的微生物,定期檢測微生物生長情況,以此判斷防腐劑的防腐效能。在釀造醬產品的微生物挑戰(zhàn)性試驗的研究甚少,因此本文采用化妝品微生物挑戰(zhàn)的方法,研究醬制品的微生物安全性,以期解釋釀造醬制品在正常儲存條件下,對于其可能污染的致病性微生物具有抑制作用,同時為其他食品種類的微生物挑戰(zhàn)性實驗奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魯氏接合酵母NRRL Y-229 本實驗室分離保藏標準菌株;Gibco DMEM高糖培養(yǎng)基 上?；鄯f生物科技有限公司;金黃色葡萄球菌CICC10384 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基、BP培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術有限公司;DMEM高糖增菌液 上海遠慕生物科技有限公司;800 g 6月香豆瓣醬 山東欣和食品工業(yè)有限公司;800 g黃豆醬 佛山市海天調味食品股份有限公司;240 g美味黃豆醬 李錦記(新會)食品有限公司;340 g原曬香黃豆醬 廣東美味鮮調味食品有限公司;250 g六必居干醬 北京六必居食品有限公司;90 g田野泉大豆醬 吉林省田野泉釀造有限公司;300 g PP盒豆瓣醬 20160510、20160512、20160514、20160516 山東欣和食品工業(yè)有限公司。

CJ-2F超凈工作臺 蘇州市金燕凈化設備有限公司;DRP-9272型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒有限公司;HL-200i型天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司:JYD-400型拍擊式均質器 上海之信儀器有限公司;mLS-3750型滅菌鍋 日本SANYO公司;LD型封口機 廣州行遠包裝機械有限公司;GYW-FG水分活度儀 廣州滬瑞明儀器有限公司;FE28臺式pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;AZ86031鹽度計 臺灣衡欣科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物挑戰(zhàn)實驗方法流程圖 利用微生物在化妝品上的微生物挑戰(zhàn)性實驗方法[11],建立食品上的微生物挑戰(zhàn)性方法。但是要明確食品微生物挑戰(zhàn)性實驗的特殊性,首先要識別出產品中存在的最難致死致病性的微生物,其次要確定該產品的細菌最大的污染程度或最差條件。因此,建立如下的微生物挑戰(zhàn)性實驗的方法見圖1。

圖1 微生物挑戰(zhàn)性實驗流程圖Fig.1 Flow chart of microbial challenge method

1.2.2 釀造醬產品的屬性 按照國際通用的美國產品大分類標準[12],常溫密封包裝產品分類通過水分活度和pH兩個指標進行分類,見表1。

表1 釀造醬制品產品分類Table 1 Product category of brewed sauce products

根據上面的指標要求,對市面的釀造醬中的6個不同品牌的豆瓣醬產品各12個樣本進行分析。利用pH計根據GB 5009.237-2016 的方法對上述產品的pH進行測定;利用水分活度以根據GB 5009.238-2016的方法對上述產品的水分活度進行測定;利用鹽度計根據GB 5009.44-2016的方法對上述產品的鹽度進行測定。最終pH、水分活度、鹽度檢測結果見表2。

通過表2的數據,對比表1的屬性分類,發(fā)現目前市場上的發(fā)酵醬產品的水分活度均低于0.85,均屬于普通類食品。

表2 釀造醬產品pH與水分活度檢測結果Table 2 Test results of the brewed sauce pH value and AW

1.2.3 目標菌的分析 因為釀造醬產品屬于普通類食品,因此在這種條件下,可能存活并繁殖的常見微生物只有部分嗜鹽細菌(Halophilicbacteria)、耐高滲微生物(Extremely osmophilic microorganisms,主要為酵母菌)。其中可致醬腐敗(脹氣等)的微生物主要是耐鹽性的酵母菌[13]。

據美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)公布的資料[14],在所有的致病菌中只有金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)具有生長繁殖的風險(金黃色葡萄球菌生長的最低水分活度0.83,產生毒素的最低水分活度0.85)。另據韓景田等對食品對十三種細菌標準菌株最低抑菌濃度測定:金黃色葡萄球菌在高于16%的鹽水中不能存活[15]。根據表2數據,釀造醬產品鹽度低于16%。

通過以上分析,因此只需要對酵母菌和金黃色葡萄球菌進行微生物挑戰(zhàn)性試驗即可。

1.2.4 細菌最大污染程度或是最差條件判定 經過對5家釀造醬生產企業(yè)灌裝車間及車間生產環(huán)境接觸面的酵母菌及金黃色葡萄球菌污染情況進行連續(xù)30 d的監(jiān)測,同時對煙臺附近3個村鎮(zhèn)24家農戶廚房及餐桌已用黃豆醬的酵母菌及金黃色葡萄球菌污染情況進行連續(xù)10 d的監(jiān)測。根據GB 4789.15-2016對酵母酵菌數量進行測定,根據GB 4789.10-2016金黃色葡萄球菌的數量進行測定。

從5家釀造生產企業(yè)連續(xù)監(jiān)控的數據得出,其車間最大酵母污染程度為102CFU/g,最大金黃色葡萄球菌污染程度為104CFU/g。從24家農戶連續(xù)監(jiān)控數據得出,其最大酵母污染程度為104CFU/g,最大金黃色葡萄球菌污染程度為106CFU/g。因此接種試驗時應該按照酵母104CFU/g、金黃色葡萄球菌106CFU/g來進行。

1.2.5 分別接種試驗

1.2.5.1 酵母接種 本實驗采用三個平行樣進行對照分析。批次為20160510 PP盒豆瓣醬三個平行樣品分別標注A1、A2、A3;批次為20160512 PP盒豆瓣醬三個平行樣品分別標注B1、B2、B3,相關指標測定結果見表3。

表3 釀造醬產品相關指標信息Table 3 Information on indexes of brewed sauce products

豆瓣醬水分活度在0.850以下,所以酵母菌的增菌采用高糖增菌液進行(總糖含量為50%),以適應待接種產品的低水分活度。將酵母菌接種到高糖增菌液中,(28±1) ℃培養(yǎng)2～4 d增菌。

使用滅菌后的高糖增菌液調整酵母增菌液濃度為105CFU/mL,每份樣品接種量為3.0 mL,接種后使用滅菌后的藥勺攪拌將樣品混合均勻,在無菌室內使用封口機封口,盒裝醬使用電熨斗加熱封口。樣品封口后放置30 ℃保溫庫保存。

在實驗進行過程中,需要進行陰性對照。在對照樣品中加入不含菌的高糖培養(yǎng)液3.0 mL,使用滅菌后的藥勺將樣品攪拌混合均勻,在無菌室內使用封口機封口,盒裝醬使用電熨斗加熱封口。樣品封口后放置30 ℃保溫庫保存[16]。

1.2.5.2 金黃色葡萄球菌接種 本實驗采用三個平行樣進行對照分析。批次為20160514三個平行樣品分別標注C1、C2、C3;批次為20160516三個平行樣品分別標注D1、D2、D3。本實驗中,批次為20160514、20160516的300 g PP盒豆瓣醬的相關指標測定結果見表4。

表4 釀造醬產品相關指標信息Table 4 Information on indexes of brewed sauce products

豆瓣醬水分活度在0.850以下,所以保存金黃色葡萄球菌接種到7.5%氯化鈉肉湯增菌,(36±1) ℃培養(yǎng)12～18 h增菌。

使用滅菌后的氯化鈉肉湯調整金黃色葡萄球菌液增菌濃度為8～9 log/mL,每份樣品接種量為3.0 mL,接種后使用滅菌后的藥勺攪拌將樣品混合均勻,在無菌室內使用封口機封口,盒裝醬使用電熨斗加熱封口。封口樣品放置于36 ℃保溫庫保存。

在實驗進行過程中,需要進行陰性對照。在對照樣品中加入無菌的7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)液3.0 mL,使用滅菌后的藥勺將樣品攪拌混合均勻,在無菌室內使用封口機封口,盒裝醬使用電熨斗加熱封口。封口后放置于36 ℃保溫庫保存[17]。

1.2.6 豆瓣醬的檢測頻率 第一周每天進行一次酵母菌、金黃色葡萄球菌檢測,然后每周進行一次檢測,待一個月后,每月檢測一次,共試驗兩個批次。同時進行水分活度(Aw)和pH的檢測,檢測頻率為每三個月檢測一次,每次檢測三個批次。由于該產品的保質期為12個月,按照保質期延長實驗的要求,因此檢測時長設定為15個月,同時進行陰性對照。

2 結果與分析

2.1 盒裝300 g豆瓣醬酵母菌挑戰(zhàn)性實驗

根據整個過程酵母菌數量的變化進行記錄,并整理出最終結果見表5;根據整個過程中pH變化進行記錄,并整理出最終結果見表6;根據整個過程中Aw變化進行記錄,并整理出最終結果見表7。

表5 豆瓣醬酵母菌挑戰(zhàn)性實驗結果Table 5 Challenging experimental results of yeast in soybean paste

表6 豆瓣醬pH檢測結果Table 6 Test results of pH in soybean paste

表7 豆瓣醬Aw檢測結果Table 7 Test results of Aw in soybean paste

根據表5數據得出,酵母菌數量在整個過程中逐漸減少,至第3 d,酵母菌數量降至<10 CFU/g,符合GB4789.15-2016食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數中細菌增殖總量的要求。綜合分析3 d后的數據,細菌總數達到相對穩(wěn)定狀態(tài)，且沒有出現增殖狀況。

根據表6數據得出,樣品pH檢測結果與對照樣檢測結果最大偏差值為0.05,符合GB5009.237-2016 食品安全國家標準 食品pH的測定中的不超過0.1的要求。樣品本身的pH變化在0.05范圍內,說明產品在這段時間內pH是相對比較穩(wěn)定的。

根據表7數據得出,樣品Aw檢測結果與對照樣檢測結果最大偏差值為0.002,符合GB5009.238-2016 食品安全國家標準食品 水分活度的測定中的在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。樣品本身的Aw值變化在0.002范圍內,說明產品在這段時間內Aw相對比較穩(wěn)定的。

綜上所述,產品的細菌變化呈遞減形式,且3 d后產品不再出現增殖,且后面維持不變,同時產品的pH、Aw也是相對比較穩(wěn)定的,說明豆瓣醬對酵母菌具有抑制作用。

2.2 盒裝300 g豆瓣醬金黃色葡萄球菌挑戰(zhàn)性實驗

根據整個過程金黃色葡萄球菌數量的變化進行記錄,并整理出最終結果見表8。

表8 豆瓣醬金黃色葡萄球菌挑戰(zhàn)性實驗結果Table 8 Challenging experimental results of Staphylococcus aureus in soybean paste

根據表8數據得出,金黃色葡萄球菌數量在整個過程中逐漸減少,至第3 d,金黃色葡萄球菌數量降至<10 CFU/g,符合GB4789.10-2016食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗中細菌增值總量的要求。綜合分析3 d后的數據,細菌總數達到相對穩(wěn)定狀態(tài)且沒有出現增值狀況。

根據表9數據的得出,樣品pH檢測結果與對照樣檢測結果最大偏差值為0.03,符合GB5009.237-2016 食品安全國家標準 食品pH的測定中的不超過0.1的要求。樣品本身的pH變化在0.03,說明產品在這段時間內pH相對比較穩(wěn)定的。

表9 豆瓣醬pH檢測結果Table 9 Test results of pH in soybean paste

根據表10數據得出,樣品Aw檢測結果與對照樣檢測結果最大偏差值為0.004,符合GB5009.238-2016 食品安全國家標準食品 水分活度的測定中的在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。樣品本身的Aw值變化在0.004范圍內,說明產品在這段時間內Aw是相對比較穩(wěn)定的。綜上所述,產品的金黃色葡萄球菌變化呈遞減形式,且三天后產品不再出現增殖,且后面維持不變,同時產品的pH、Aw也是相對比較穩(wěn)定的,說明豆瓣醬對金黃色葡萄球菌具有抑制作用。

表10 豆瓣醬Aw檢測結果Table 10 Test results of Aw in soybean paste

3 結論

酵母菌、金黃色葡萄球菌在細菌污染到最大量的條件下,經過3 d,細菌總數降至<10 CFU/g,同時監(jiān)測的樣品pH、Aw檢測結果不論與對照樣的變化,還是與自身的變化對比都符合相關要求,達到了微生物挑戰(zhàn)的實驗目的。說明Aw小于0.85的釀造醬產品對酵母菌、金黃色葡萄球菌具有抑制的作用。通過實驗證實,即使釀造醬產品污染一定數量的致病菌,經過一段時間之后,產品本身可以恢復到產品的最初的安全狀態(tài),符合食品安全性的要求。

該實驗結合食品自身的特性,參考化妝品風險挑戰(zhàn)實驗的方法。因此,實驗過程和結果具有一定的科學性和參考價值。但是該實驗也具有一定的局限性,在低酸酸化食品、無菌罐裝食品的風險挑戰(zhàn)性實驗中,由于需要加入熱力殺菌的步驟,因此在方法設置上還需要進一步完善。