(福建省食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院,福建福州 350000)

硝基咪唑類藥物是一類5位被硝基取代的雜環(huán)化合物,主要包括甲硝唑、地美硝唑、洛硝噠唑、替硝唑等[1]。該類藥物有抗菌和抗原蟲作用,并具有成本低、療效快的特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品養(yǎng)殖中寄生蟲的防治與感染。研究表明,該類藥物及其代謝產(chǎn)物具有潛在的致癌、致病變及損傷DNA的作用[2],因此,我國(guó)對(duì)于硝基咪唑類藥物在動(dòng)物源性食品養(yǎng)殖及生產(chǎn)過(guò)程中的應(yīng)用進(jìn)行了嚴(yán)格的控制[3-4]。

目前,測(cè)定硝基咪唑類抗生素及其代謝物的方法主要有氣相色譜法[5]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、高效液相色譜法[7]和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[8]等。由于液相色譜法的檢出限較高,基質(zhì)干擾較大,難于定量;氣相色譜法及氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法抗干擾能力較弱,適用范圍相對(duì)較窄;而液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)具有較低的檢出限、較高的抗干擾能力及適用范圍廣等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于硝基咪唑及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)。我國(guó)現(xiàn)行有效的動(dòng)物源性食品及飼料[9]中硝基咪唑及其代謝物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中檢測(cè)方法主要是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法,故而本文選取該方法為檢測(cè)方法。

硝基咪唑及其代謝產(chǎn)物殘留檢測(cè)常用到的前處理方法有液液萃取[10]、固相萃取[11]和QuEChERS[12]等。QuEChERS技術(shù)因高效、快速、成本低等特點(diǎn),被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域[13]。常規(guī)用于獸藥檢測(cè)前處理的QuEChERS試劑成分主要是十八烷基鍵合硅膠吸附劑、N-丙基乙二胺吸附劑和無(wú)水硫酸鎂,可滿足大部分動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的檢測(cè),但是對(duì)于磷脂含量較高的食品,經(jīng)QuEChERS試劑包處理后,仍會(huì)出現(xiàn)基質(zhì)干擾,導(dǎo)致靈敏度和測(cè)量準(zhǔn)確性降低。鋯離子或鋯氧化物與磷酸根或基團(tuán)具有強(qiáng)的配位作用,Xiangyang等[14]利用UIO-67中的鋯氧簇中的鋯來(lái)吸附水樣中的草甘膦和草胺磷,彭西甜等[15]、姚凱等[16]利用該機(jī)理用納米級(jí)的二氧化鋯吸附脂類及磷脂。本文同樣基于該機(jī)理,在QuEChERS試劑中加入二氧化鋯顆粒用于吸附磷脂來(lái)降低基質(zhì)干擾,同時(shí)參考已有的研究和標(biāo)準(zhǔn),擬建立改進(jìn)的QuEChERS方法結(jié)合HPLC-MS/MS來(lái)測(cè)定動(dòng)物源性食品中的硝基咪唑類藥物,并以魚肉為代表性基質(zhì),以兩種硝基咪唑藥物和一種代謝產(chǎn)物為目標(biāo)獸藥,并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件及QuEChERS試劑量進(jìn)行優(yōu)化,以期滿足魚肉中硝基咪唑及其代謝產(chǎn)物殘留的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲硝唑(Metronidazole,MNZ) 中國(guó)食品藥品檢定研究院;羥甲基甲硝咪唑(2-hydroxymethyl-1-methyl-5-nitroimidazole,HMMNI) 德國(guó)WITEGA公司;地美硝唑(Dimetridazole,DMZ) Dr. Ehrenstorfer公司;乙酸乙酯、乙腈色譜純 美國(guó)TEDIA公司;乙酸銨、氨水、甲酸 色譜純,上海阿拉丁公司;二氧化鋯(粒徑200～400 nm) 美國(guó)Sigma公司;十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)、N-丙基乙二胺吸附劑(PSA)、無(wú)水硫酸鎂 博納艾潔爾公司;超純水 由Milli Q系統(tǒng)制得,美國(guó)Milipore公司;實(shí)驗(yàn)所用的魚肉 均為市售的鮮活海鱸魚,宰殺后取可食用部分搗碎所得。

API5500型四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀配電子噴霧離子源 美國(guó)AB公司;Agilent 1290型超高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司;Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm) 美國(guó)Agilent公司;Hei-VAP Precision減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司;CR21N高速冷凍離心機(jī) 日本HITACHI公司;SW22恒溫水浴振蕩器 丹麥FOSS公司;VORTEX 4 digital渦旋混合器 德國(guó)IKA公司;HM100刀式研磨儀 北京格瑞德曼公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和緩沖液的配制 準(zhǔn)確稱取各硝基咪唑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.0 mg,用甲醇溶解并定容至10.0 mL,配得濃度為1.0 mg/mL的單標(biāo)溶液;準(zhǔn)確吸取上述各單標(biāo)溶液適當(dāng)體積于100.0 mL容量瓶中,用甲醇定容配得濃度為1000 ng/mL的三種物質(zhì)混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液;于4 ℃下避光保存。稱取乙酸銨14.4 g用9000 mL水溶解,再用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5.2,然后定容至1000.0 mL混勻后得乙酸緩沖液。

1.2.2 液相色譜與質(zhì)譜條件 Agilent Eclipse Pluse C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)。流動(dòng)相:0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B);梯度洗脫程序:0～3.0 min,95%～5% A;3.0～5.0 min,5%～5%;5.0～5.1 min,5%～95%;5.1～7.0 min,95%～95%;柱溫:30 ℃;流速:0.25 mL/min;進(jìn)樣量:1.0 μL。本實(shí)驗(yàn)著重考察了0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇、0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈做為流動(dòng)相時(shí),對(duì)各物質(zhì)的峰型及分離效果的影響。

電子噴霧離子源(ESI),正離子掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式(MRM);離子源溫度:450 ℃;電噴霧電壓:4500 V;氣簾氣壓:30 Psi;霧化氣壓:55.0 Psi;輔助氣壓力:55.0 Psi;碰撞室入口電壓:10 V;碰撞室出口電壓:15 V。

在優(yōu)化質(zhì)譜條件時(shí),采用直接進(jìn)樣的方式,分別將50 μg/L的單標(biāo)液注入離子源,在ESI正離子模式下,獲得準(zhǔn)分子離子峰。參考?xì)W盟2002/657/EC的規(guī)定,以準(zhǔn)分子離子峰為母離子,選擇響應(yīng)值較高的兩個(gè)碎片作為子離子,和母離子組成離子對(duì),同時(shí)分別優(yōu)化各離子對(duì)的碰撞能量、去簇電壓、碰撞室出口及入口電壓。為保證三種硝基咪唑的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度,本文采用多反應(yīng)監(jiān)控模式(MRM),見表1。

表1 3種硝基咪唑類的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式下的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric conditions (MRM)of three nitromidazoles

1.2.3 樣品前處理方法及優(yōu)化 魚肉樣品的制備:取魚的可食部分,刀式研磨儀以8000 r/min 的速度,2 min充分搗碎混合均勻后,分裝入潔凈的聚四氟乙烯材質(zhì)的小瓶中,密封,并于-18 ℃以下冷凍存放,每次使用前取一份分裝樣品,常溫充分解凍,待回溫至室溫后稱取,且每份分裝樣品解凍稱取后即棄去。

稱取2.00 g魚肉于50 mL離心管中,加入8 mL乙酸銨緩沖液,渦旋混勻,室溫靜置,加入15 mL提取溶劑、5.0 g無(wú)水硫酸鈉,高速渦旋混勻后,放于室溫水平振蕩器中,振蕩提取10 min,在4 ℃條件下,以9500 r/min的高速離心5 min,取上清液;殘?jiān)貜?fù)提取一次后,合并兩次提取液,待凈化。向提取液中加入凈化劑(100 mg PSA、40 mg C18、600 mg無(wú)水硫酸鎂及一定量的二氧化鋯),高速渦旋1 min混勻,在4 ℃條件下,以9500 r/min的高速離心5 min,吸取全部有機(jī)相,40 ℃下在減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)至近干,精密加入1 mL 0.1%甲酸水-乙腈(95∶5,體積比),渦旋溶解殘?jiān)?過(guò)0.22 μm濾膜,待上機(jī)。

1.2.3.1 提取溶劑的選擇 按照1.2.2儀器條件及1.2.3提取過(guò)程,考察不同提取溶劑對(duì)樣品中硝基咪唑的提取效率,本文比較1%氨水-乙腈、1%氨水-甲醇、1%氨水-乙酸乙酯的提取效率,在其他實(shí)驗(yàn)條件不變的前提下,提取效率是通過(guò)加入相同量(3 μg/kg)標(biāo)準(zhǔn)溶液,不同提取溶劑的回收率高低來(lái)確定。

1.2.3.2 二氧化鋯加入量的確定 考察不同加入量的二氧化鋯,對(duì)樣品基質(zhì)凈化效果的影響。在本文中,C18、PSA和無(wú)水硫酸鎂的量參照SN/T 3235-2012中的量[17]加入,對(duì)二氧化鋯的量(0、10、20、40、60、80、100 mg)進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)比較在加入相同加標(biāo)量時(shí)(3 μg/kg),三種硝基咪唑峰面積的大小,確定最佳的二氧化鋯加入量。

1.2.4 基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算 基質(zhì)效應(yīng)是質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程中影響方法靈敏度、精密度及準(zhǔn)確度的主要因素之一[18]。本文采用相對(duì)響應(yīng)值法來(lái)評(píng)價(jià)三種硝基咪唑類的基質(zhì)效應(yīng):

式(1)

式中:Ay為基質(zhì)配標(biāo)響應(yīng)值,A0為溶劑配標(biāo)響應(yīng)值。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)的為正值時(shí),表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng);當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)為負(fù)值時(shí),表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng);基質(zhì)效應(yīng)的絕對(duì)值越大,基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)。通常認(rèn)為,基質(zhì)效應(yīng)的絕對(duì)值小于20%時(shí),可以認(rèn)為基質(zhì)干擾對(duì)結(jié)果的影響不大,但當(dāng)其絕對(duì)值大于20%時(shí),基質(zhì)效應(yīng)不可忽略。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限 按照1.2.3步驟處理空白樣品得空白基質(zhì)溶液,取適量的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,以空白基質(zhì)溶液定容至質(zhì)量溶度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按照1.2.2的條件進(jìn)樣,以質(zhì)量溶度為橫坐標(biāo),以分析物的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)是通過(guò)空白樣品加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的方法測(cè)定的,其中當(dāng)信噪比RS/N≥3.0時(shí)的含量為檢出限,RS/N≥10.0時(shí)的含量為定量限。

1.2.6 回收率及精密度實(shí)驗(yàn) 取空白魚肉樣品,三種硝基咪唑的添加濃度依次為:MNZ 0.2、0.4、1.0 μg/kg,DMZ 0.2、0.4、1.0 μg/kg,HMMNI 0.5、1.0、2.5μg/kg三個(gè)水平標(biāo)液,每個(gè)濃度平行6次試驗(yàn),前處理方法參照1.2.3,儀器條件參照1.2.2,進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Analyst及MultiQuantTM軟件進(jìn)行分析,采用Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在正離子模式條件下,甲酸的加入可以增大離子化效率[17],同時(shí)參考了文獻(xiàn)及現(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),甲酸的含量在0.1%時(shí),結(jié)果最優(yōu)。所以本實(shí)驗(yàn)著重考察了0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇、0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈做為流動(dòng)相時(shí)各物質(zhì)的分離效果。對(duì)比各流動(dòng)相的標(biāo)液譜圖,發(fā)現(xiàn)以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈作為流動(dòng)相時(shí),分離效果最佳,峰型較好無(wú)拖尾現(xiàn)象,故在本文中選用0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈作為流動(dòng)相,三種化合物的總離子流圖見圖1。

圖1 3種硝基咪唑類藥物的定量離子流圖Fig.1 MRM chromatograms of quantitative ion pairs for 3 nitromidazoles注:A、B、C依次為DMZ、HMMNI、MNZ。

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

在檢測(cè)硝基咪唑類藥物時(shí),常被用到的提取劑主要有乙腈[12,19-21]、乙酸乙酯[22]、甲醇[23]及一些混合試劑。硝基咪唑類藥物是酸堿兩性化合物,在弱酸性條件下可以質(zhì)子化,在弱堿性條件下則以游離分子形式存在,據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道,DMZ、MNZ兩種對(duì)提取溶劑的pH要求不高,但是HMMNI的提取效率在中性或者酸性條件下較低,故本文在提取劑中加入了氨水。如圖2所示,1%氨水-甲醇的提取效率最低;1%氨水-乙酸乙酯的提取效率最高,且在旋蒸過(guò)程中所需的溫度低,時(shí)間短;1%氨水-乙腈提取效率相對(duì)較高,同時(shí)乙腈可以有效地沉淀動(dòng)物源性食品中的蛋白質(zhì),且脂肪提取率低,故而基質(zhì)影響最小。綜合考慮后,最后選擇1%氨水-乙腈作為提取劑。

圖2 提取劑對(duì)硝基咪唑類藥物提取回收率的影響Fig.2 Effects of different solvent combination on the recovery rate of three nitromidazoles

2.3 二氧化鋯加入量的優(yōu)化

在獸藥殘留量分析的過(guò)程中,分散固相萃取法常用到的凈化吸附劑有C18、PSA和無(wú)水硫酸鎂三種,可以高效地去除樣液中的脂肪、色素、金屬離子和有機(jī)酸等,但是動(dòng)物源性產(chǎn)品中磷脂含量較高,且磷脂對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響,常用的C18和PSA對(duì)磷脂的去除效率不高,加大C18和PSA的量會(huì)降低一部分獸藥的回收率。利用磷酸基團(tuán)與鋯的強(qiáng)配位作用,在凈化劑中加入二氧化鋯微球,可高效除去提取液中的磷脂,這樣既可以避免因加入過(guò)量C18和PSA降低回收率,同時(shí)又可消除磷脂帶來(lái)的基質(zhì)影響。結(jié)果如圖3所示,加入二氧化鋯后,三種化合物的峰面積有了明顯的提高,說(shuō)明二氧化鋯的加入有效吸附了基質(zhì)中的磷脂,減小了基質(zhì)抑制效應(yīng)帶來(lái)的影響。隨著二氧化鋯加入量的增大,三種化合物的峰面積基本維持不變,因?yàn)樗Q取的魚肉質(zhì)量有限,提取出的磷脂量有限,10 mg二氧化鋯足以吸附提取液中的磷脂,同時(shí)考慮到各實(shí)驗(yàn)樣品磷脂含量的差異性問(wèn)題及實(shí)驗(yàn)成本,最終確定二氧化鋯吸附劑的用量為20 mg。

圖3 二氧化鋯加入量對(duì)峰面積的影響Fig.3 Effects of different ZrO2 addition on the peak area of three nitromidazoles

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

由圖4可見,MNZ、HMMNI、DMZ的基質(zhì)效應(yīng)分別為-34.8%、-28.4%、-34.7%,三種化合物的基質(zhì)效應(yīng)均為負(fù)值,且絕對(duì)值均大于20%,說(shuō)明基質(zhì)對(duì)三種化合物存在明顯的抑制作用,原因可能為,前處理過(guò)程中,魚肉中的可溶性蛋白、多肽等內(nèi)源性物質(zhì)隨目標(biāo)物共同流出,在質(zhì)譜分析電離過(guò)程中這些共同流出物抑制了目標(biāo)物的離子化。由于無(wú)法獲得與檢測(cè)化合物一一對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)物,因此本文采用更為常見的基質(zhì)配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法,來(lái)降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

圖4 三中硝基咪唑的基質(zhì)效應(yīng)Fig.4 Matrix effects of the three nitromidazoles

2.5 線性方程、檢出限和定量限

如表2所示,三種化合物的在0.5～20 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,R2均大于0.998;MNZ和DMZ的檢出限為0.2 μg/kg,HMMNI的檢出限為0.5 μg/kg,MNZ和DMZ的定量限為 0.6 μg/kg,HMMNI的定量限為1.2 μg/kg。

表2 三種硝基咪唑的線性方程、線性范圍、檢出限、定量限Table 2 Linear equations linear relationships,LODs,LOQs of three nitromidazoles

2.6 回收率和精密度

如表3所示,三種硝基咪唑在三個(gè)加標(biāo)水平下的回收率在88.1%～107.0%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.43～8.17%之間。方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度,符合實(shí)際檢測(cè)要求。

表3 三種硝基咪唑的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations of three nitromidazoles(n=6)

2.7 市售樣品檢測(cè)

按照優(yōu)化后的處理方法及色譜條件,對(duì)本地不同超市市售的50批次魚樣品進(jìn)行DMZ、HMMNI及MNZ的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,只有1批次的鰻魚檢出MNZ,其含量為0.7 μg/kg,其余產(chǎn)品均未檢出這三種硝基咪唑類藥物。

3 結(jié)論

本文針對(duì)動(dòng)物源性產(chǎn)品中磷脂含量高的基質(zhì)特點(diǎn),結(jié)合已有的研究及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),通過(guò)加入二氧化鋯,改進(jìn)了傳統(tǒng)的QuEChERs方法以消除魚肉樣品中磷脂帶來(lái)的基質(zhì)干擾,并優(yōu)化儀器分析參數(shù)、樣品前處理及二氧化鋯加入量。與傳統(tǒng)的QuEChERs相比,分析方法的選擇性及靈密度有所提高,其檢出限在0.2～0.5 μg/kg之間,定量限為0.6～1.2 μg/kg之間;平均回收率在88.1%～107.0% 范圍內(nèi),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在 2.43%～8.17%范圍內(nèi)。該方法具有準(zhǔn)確、高效、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),適用于魚肉中DMZ、HMMNI及MNZ的快速檢測(cè)和日常篩查。雖然本文只選取了兩種硝基咪唑及一種其代謝產(chǎn)物作為目標(biāo)分析物,但文中的前處理方法可能適用于具有相似分子結(jié)構(gòu)的其他類硝基咪唑類藥物,乃至其他獸殘類藥物的檢測(cè)。