張會(huì)強(qiáng)，徐錦岳,張秦銘,馬文鵬,王 斐,白 昭

(1.陜西省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，陜西 西安 710054; 2.大連理工大學(xué)生命與醫(yī)藥學(xué)院，遼寧 盤(pán)錦 124221)

糞大腸菌群是在44.5℃溫度下能生長(zhǎng)并發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，主要來(lái)自糞便。糞大腸菌群又稱(chēng)耐熱大腸菌群，可以指示水體是否遭受糞便污染，直接指示生活污水的污染，間接反映腸道致病菌的污染風(fēng)險(xiǎn)，是水質(zhì)檢驗(yàn)中非常重要的衛(wèi)生指標(biāo)。

目前，國(guó)內(nèi)測(cè)定水中糞大腸菌群的標(biāo)準(zhǔn)分析方法有多管發(fā)酵法[1]、濾膜法[1]、紙片快速法[2]和酶底物法[3]。多管發(fā)酵法早在1985年就列入了《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》(GB 5750-85)，至今已經(jīng)沿用了三十多年，是行業(yè)內(nèi)公認(rèn)的糞大腸菌群測(cè)定的經(jīng)典方法，衛(wèi)生、水利、環(huán)保等行業(yè)均有多管發(fā)酵法的方法標(biāo)準(zhǔn)。美國(guó)公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)(APHA)出版的《水和廢水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》(20版)中方法9221E也采用的是多管發(fā)酵法[4]；濾膜法采用直接計(jì)數(shù)特征菌落的方式，不同于其它三種方法采用MPN法計(jì)數(shù)，其應(yīng)用廣泛性?xún)H次于多管發(fā)酵法，美國(guó)APHA方法9222D[4]和ISO9308-1:2014[5]采用的是濾膜法；紙片快速法在西方發(fā)達(dá)國(guó)家采用較少，主要在一些發(fā)展中國(guó)家使用，環(huán)保部在2015年發(fā)布了測(cè)定水中糞大腸菌群的紙片快速法[2]；酶底物法利用糞大腸菌群在鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)生β-D-半乳糖苷酶，該酶可以分解色源底物釋放出黃色的鄰硝基苯酚，通過(guò)顏色變化定性，MPN法定量。我國(guó)沒(méi)有酶底物法測(cè)定糞大腸菌群的現(xiàn)行國(guó)家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，美國(guó)APHA方法9221 E[4]、ISO 9380-2:2012[6]和GB5750.12-2006[7]均將酶底物法列入標(biāo)準(zhǔn)，但僅限測(cè)定總大腸菌群和大腸埃希氏菌。2018年4月陜西省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布了酶底物法測(cè)定糞大腸菌群的地方標(biāo)準(zhǔn)[3]，填補(bǔ)了酶底物法測(cè)定糞大腸菌群的標(biāo)準(zhǔn)方法空白。

現(xiàn)參照環(huán)保行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)HJ/T347-2007、HJ 755-2015和DB61/T 1138-2018，對(duì)多管發(fā)酵法、濾膜法、紙片快速法和酶底物法分別從檢出限、方法操作、準(zhǔn)確度、方法間一致性進(jìn)行了對(duì)比研究。

1 儀器、試劑和耗材

GNP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱(37℃，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱(44.5℃，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；LDZX-50KBS不銹鋼立式滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng))；Whatman MBSI微生物過(guò)濾系統(tǒng)(美國(guó)GE公司)；LK-2010A型程控定量封口機(jī)(西安立科環(huán)?？萍加邢薰?；酶底物法試劑、100mL無(wú)菌定量瓶、51孔和97孔定量檢測(cè)盤(pán)(均購(gòu)自西安立科環(huán)?？萍加邢薰?；定量菌株Quanti-Cult Plus(美國(guó)ThermoFisher公司)；大腸菌群檢驗(yàn)紙片(廣州達(dá)元綠洲生化科技有限公司)；乳糖蛋白胨、EC肉湯、MFC培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)；移液器(德國(guó)Eppendorf)；實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min后的無(wú)菌水；槍頭等其他耗材。微生物檢測(cè)數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布[8]，按照其統(tǒng)計(jì)分析要求，以下所有檢測(cè)數(shù)據(jù)均經(jīng)對(duì)數(shù)(以10為底)轉(zhuǎn)換后，再進(jìn)行分析計(jì)算。

2 方法對(duì)比

2.1 方法檢出限

方法檢出限取決于取樣量和最低檢出值，MPN法的檢出限為各個(gè)稀釋管為陰性時(shí)對(duì)應(yīng)的MPN值。多管發(fā)酵法的接種量為300mL時(shí)，查HJ/T347-2007中表 2 可得該方法的檢出限為3MPN/L[1]；濾膜法為直接菌落計(jì)數(shù)法，當(dāng)取1L水樣時(shí)方法的檢出限為0cfu/L；紙片快速法查HJ 755-2015中附錄B表可得該方法的檢出限為20MPN/L[2]；酶底物法的接種量為300mL時(shí)，查DB61/T 1138-2018中表B.1該方法的檢出限為3MPN/L[3]。

2.2 方法操作

多管發(fā)酵法需要配制乳糖蛋白胨培養(yǎng)基等準(zhǔn)備工作，初發(fā)酵和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，檢測(cè)時(shí)間>72h；濾膜法需要配制MFC培養(yǎng)基等準(zhǔn)備工作，初發(fā)酵試驗(yàn)，必要時(shí)需要復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)確認(rèn)，檢測(cè)時(shí)間>48h；紙片快速法直接接種商品化紙片，無(wú)須配制培養(yǎng)基，檢測(cè)時(shí)間>24h；酶底物法采用商品化培養(yǎng)基，無(wú)須配制培養(yǎng)基，檢測(cè)時(shí)間>24h。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)定量菌株實(shí)驗(yàn)

取Quanti-Cult Plus定量菌株R4717085(真值為66cfu/0.1mL菌液)按照說(shuō)明書(shū)制備成稀釋菌液。分別用多管發(fā)酵法、濾膜法、紙片快速法和酶底物法取0.1mL菌液進(jìn)行檢測(cè)，多管發(fā)酵法和紙片快速法取0.1mL菌液加入到9.9mL無(wú)菌水中，然后接種5份1.0mL、5份0.1mL、5份0.01mL，結(jié)果計(jì)算見(jiàn)公式(1)；濾膜法取0.1mL菌液加入到9.9mL無(wú)菌水中，旋渦振勻后進(jìn)行過(guò)濾，計(jì)數(shù)陽(yáng)性菌落為檢測(cè)結(jié)果；酶底物法取0.1mL菌液加入100mL無(wú)菌定量瓶中，無(wú)菌水定容后用51孔定量檢測(cè)盤(pán)檢驗(yàn)，查51孔MPN表計(jì)數(shù)結(jié)果。每種方法做3個(gè)平行樣。

(1)

式中：C-0.1mL菌液中糞大腸菌群的數(shù)量，MPN/0.1mL；MPN-查15管MPN表所得的MPN值；接種量最大的一管(或紙片)體積是1.0mL，先換算成100mL中的MPN濃度，再折算成10mL稀釋菌液中濃度即0.1mL菌液的MPN值。

表1 四中方法標(biāo)準(zhǔn)定量菌株檢測(cè)數(shù)據(jù)匯總表

2.4 相關(guān)性比較

實(shí)驗(yàn)選取了55個(gè)不同來(lái)源的水樣同時(shí)用多管發(fā)酵法、濾膜法、紙片快速法和酶底物法在相同的取樣量(55.5mL或5.55mL)和相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行檢測(cè)，將酶底物法、紙片快速法和濾膜法的檢測(cè)結(jié)果分別與經(jīng)典的多管發(fā)酵法進(jìn)行相關(guān)性分析(見(jiàn)圖1～圖3)。

圖1 多管發(fā)酵法與酶底物法測(cè)定糞大腸菌群的相關(guān)性分析

圖2 多管發(fā)酵法與紙片快速法測(cè)定糞大腸菌群的相關(guān)性分析

圖3 多管發(fā)酵法與濾膜法測(cè)定糞大腸菌群的相關(guān)性分析

采用SPSS18軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。多管發(fā)酵法分別與酶底物法配對(duì)t檢驗(yàn)的p值為0.178；多管發(fā)酵法分別與紙片快速法配對(duì)t檢驗(yàn)的p值為0.450；多管發(fā)酵法分別與濾膜法配對(duì)t檢驗(yàn)的p值為0.012。

3 結(jié)果與討論

從方法的檢出限來(lái)看，濾膜法不受取樣量限制(只要水樣不堵塞濾膜)，檢出限最低；多管發(fā)酵法和酶底物法的最低檢出限同為3MPN/L；紙片快速法的檢出限為20MPN/L。

從實(shí)驗(yàn)操作來(lái)看，多管發(fā)酵法和濾膜法均需要配制培養(yǎng)基，而且進(jìn)行復(fù)發(fā)酵，操作繁瑣；紙片快速法和酶底物法無(wú)需配制培養(yǎng)基，操作簡(jiǎn)單。因此，多管發(fā)酵法工作量大，耗費(fèi)時(shí)間最長(zhǎng)；濾膜法操作強(qiáng)度和耗費(fèi)時(shí)間略低于多管發(fā)酵法；紙片快速法和酶底物法操作簡(jiǎn)便，更適用于大量樣品的快速檢驗(yàn)。

從定量菌株檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，多管發(fā)酵法的相對(duì)誤差范圍為-7.1%～16.2%，最終值為4.5%±11.6%；紙片快速法的相對(duì)誤差范圍為-16.6%～4.3%，最終值為-6.1%±10.4%；濾膜法的相對(duì)誤差范圍為-13.2%～4.9%，最終值為-4.2%±9.0%；酶底物法的相對(duì)誤差范圍為2.1%～6.8%，最終值為4.4%±2.4%。因此，酶底物法的準(zhǔn)確度均優(yōu)于其它三種方法；酶底物法平行樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%，精密度也優(yōu)于其它三種方法。

從相關(guān)性比較來(lái)看，多管發(fā)酵法分別與酶底物法配對(duì)t檢驗(yàn)的p值=0.178>0.05，方法間無(wú)顯著性差異；多管發(fā)酵法分別與紙片快速法配對(duì)t檢驗(yàn)的p值=0.450>0.05，方法間無(wú)顯著性差異；多管發(fā)酵法分別與濾膜法配對(duì)t檢驗(yàn)的p值=0.012<0.05，存在顯著性差異。因?yàn)榧埰焖俜ê投喙馨l(fā)酵法均采用15管MPN法定量，而酶底物法采用51孔或97孔MPN法定量，所以紙片快速法與多管發(fā)酵法的相關(guān)性更好(0.450>0.178)。濾膜法采用直接菌落計(jì)數(shù)(cfu)，采用該方法時(shí)須與多管發(fā)酵法的數(shù)據(jù)進(jìn)行可比性驗(yàn)證。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，多管發(fā)酵法、濾膜法、紙片快速法和酶底物法在檢出限、實(shí)驗(yàn)操作、準(zhǔn)確性和精密度、檢測(cè)時(shí)間、適用范圍等(見(jiàn)表2)均存在差異。多管發(fā)酵法和紙片快速法已經(jīng)列為《國(guó)家地表水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測(cè)網(wǎng)監(jiān)測(cè)任務(wù)作業(yè)指導(dǎo)書(shū)》(試行)的指定方法。多文獻(xiàn)報(bào)道酶底物法適用于當(dāng)前環(huán)境監(jiān)測(cè)工作迫切需要[9-10]，在實(shí)際工作中應(yīng)根據(jù)上述方法的特點(diǎn)選擇合適的分析方法。

表2 四中測(cè)定水中糞大腸菌群方法的對(duì)比匯總