楊曉飛，梅林，薛秀恒，王志耕*

1(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品加工工程實驗室,安徽 合肥，230036) 2(安慶市食品藥品稽查支隊，安徽 安慶，246001)

風(fēng)味是食品的重要特征之一，是消費者評價食品品質(zhì)的一個重要指標(biāo)[1-2]。香精香料是現(xiàn)代食品工業(yè)不可或缺的材料[2-3]。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，消費者對食品風(fēng)味的要求不斷提高，例如要求食品風(fēng)味圓潤、柔和、可持續(xù)釋放等。同時天然香精香料也越來越受到廣大消費者的青睞[4]。為此，新型風(fēng)味劑的開發(fā)是食品新材料創(chuàng)新研究的重要領(lǐng)域之一。

甜橙油風(fēng)味特征鮮明，口感柔和，在食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用。但甜橙油具有不溶于水、易揮發(fā)、持續(xù)釋放性能較差等缺陷[1,3-4]。目前技術(shù)多采用β-環(huán)糊精、麥芽糊精或阿拉伯膠等作為甜橙油的添加載體，將甜橙油制成微膠囊或包合物，以擴展甜橙油在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍[1-3,5-6]。研究表明，蛋白質(zhì)分子帶有許多雙親基團,具有良好的結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)的能力[7]。在水溶液中，蛋白質(zhì)的疏水基團能夠通過以疏水相互作用為主要動力吸附在油溶性的液滴表面，形成一層蛋白質(zhì)膜，將油滴包裹形成包合物，或者將油性液滴吸附固定在蛋白質(zhì)疏水空穴內(nèi)，而親水基團通過氫鍵與水分子相互作用，從而形成穩(wěn)定的包合物乳液并使包合物具有良好的水溶性[4,8-13]。乳清蛋白來源于牛乳，同時又具有大量的雙親基團以及疏水空穴[10,12-13]。本文采用正交試驗對高壓均質(zhì)制備乳清蛋白-甜橙油包合物工藝參數(shù)進行優(yōu)化，并系統(tǒng)地分析了乳清蛋白-甜橙油包合物的性質(zhì)，以期為甜橙油新材料的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

WPC-80乳清蛋白粉,美國Glanbia公司；甜橙油(0.84 mg/mL),廣州日化化工有限公司；Na2CO3、K2SO4、NaCl、石油醚(60～90 ℃)、無水乙醇和正己烷，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

智能水分活度儀(HD-3A型)，無錫市華科儀器儀表有限公司；紫外分光光度計(Lambda 35),美國Perkin Elmer公司；超高壓納米均質(zhì)機(APV-2000型)，北京同和友德科技有限公司；真空冷凍干燥機(Christ L-1)，德國Martin-Christ公司；數(shù)控超聲波清洗器(KQ3200DE型)，昆山市超聲儀器有限公司；氣相色譜儀(7890A)，安捷倫科技有限公司；質(zhì)譜儀(5975c)，安捷倫科技有限公司；激光粒度分析儀(MS2000)，英國馬爾文儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 甜橙油-乳清蛋白包合物的制備

1.2.1.1 包合物的制備方法

配制100 g/L乳清蛋白溶液，邊攪拌邊加入甜橙油，然后再邊攪拌邊經(jīng)超高壓納米均質(zhì)機均質(zhì)，得到納米包合物乳液。將50 mL包合物乳液置于直徑150 mm的培養(yǎng)皿中，于-80 ℃條件下預(yù)冷凍4 h，再經(jīng)真空冷凍干燥30 h得到乳清蛋白-甜橙油包合物固體，粉碎，經(jīng)80目篩過濾，得包合物粉末。

1.2.1.2 甜橙油包合率的測定

分別取1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05、0 mL甜橙油于100 mL容量瓶中，用石油醚定容，混勻，制備質(zhì)量濃度為8.40、6.72、5.04、3.36、1.68、0.84、0.42、0 mg/mL的甜橙油石油醚標(biāo)準(zhǔn)溶液，在307 nm波長處測定其吸光度。甜橙油的石油醚溶液的質(zhì)量濃度在0～8.40 mg/mL范圍內(nèi)時，濃度(X1)和吸光度(Y1)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程為：Y1=0.206 2X1+0.018 0(R2=0.999 4)。以同樣的方法配制甜橙油無水乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其在317 nm波長處的吸光度，當(dāng)甜橙油的無水乙醇溶液質(zhì)量濃度在0～8.40 mg/mL范圍內(nèi)時，濃度(X2)和吸光度(Y2)之間也呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程為Y2=0.198 7X2-0.004 1(R2=0.999 3)。

根據(jù)文獻[14-15]中的方法并略作改進，稱取0.5 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL石油醚，輕微振蕩1 min，然后3000 r/min離心1 min，傾出石油醚相，再向沉淀中加入10 mL石油醚，重復(fù)上述操作2次，合并石油醚相，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后，在307 nm處測定吸光度；根據(jù)線性方程Y1=0.206 2X1+0.018 0計算包合物表面甜橙油含量。

根據(jù)文獻[15-16]中的方法并略作改進，稱取0.5 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL無水乙醇，30 ℃、90 W超聲提取10 min，3 000 r/min下離心1 min，傾出無水乙醇相，再向沉淀中加入10 mL無水乙醇，重復(fù)上述操作3次，合并無水乙醇相，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后，在317 nm處測其吸光度；根據(jù)線性方程Y2=0.198 7X2-0.004 1計算包合物載有甜橙油總量。

包合率是指反應(yīng)體系中實際被有效包合的甜橙油的質(zhì)量與加入的甜橙油的總質(zhì)量之比。

(1)

M2=M1×M

(2)

(3)

式中：m1，包合物含有甜橙油總量，g；m2，包合物表面甜橙油含量，g；m，包合物質(zhì)量，g；M1，單位質(zhì)量蛋白包合的甜橙油含量，g/g；M2，反應(yīng)體系中蛋白包合的甜橙油的總量，g；M，反應(yīng)體系中蛋白的總質(zhì)量，g；V，反應(yīng)體系中加入的甜橙油體積，mL；ρ，甜橙油密度，0.84 g/mL。

1.2.1.3 包合物制備工藝的正交試驗優(yōu)化

以均質(zhì)次數(shù)、均質(zhì)壓力和乳清蛋白的質(zhì)量與甜橙油的體積比為因素，以包合率為指標(biāo)，設(shè)計3因素3水平的正交試驗優(yōu)化制備工藝，對結(jié)果進行直觀分析和方差分析，確定最佳制備條件。因素水平編碼表如表1所示。

表1 正交設(shè)計試驗因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.2.2 包合物的性質(zhì)研究

1.2.2.1 紫外-可見光光譜分析

利用紫外分光光度計測定甜橙油、乳清蛋白、甜橙油和乳清蛋白的物理混合物以及包合物的石油醚溶液和無水乙醇溶液在200～400 nm范圍內(nèi)的吸收光譜[14,17]。分別將甜橙油和乳清蛋白溶于石油醚溶液和無水乙醇溶液中，掃描溶液在200～400 nm范圍內(nèi)的吸收光譜。再用石油醚洗滌物理混合物和包合物，測定洗脫液在200～400 nm范圍內(nèi)的吸收光譜，直至洗脫液在307 nm處的吸光度接近0并且恒定不變，然后再用無水乙醇提取沉淀物中的甜橙油，掃描提取液在200～400 nm范圍內(nèi)的吸收光譜。

1.2.2.2 包合物中甜橙油組分分析

根據(jù)文獻[1,18]中的方法并略作改進，對甜橙油原油和包合物中的甜橙油進行組成成分分析。將0.1 mL甜橙油溶于20 mL正己烷中，混勻。然后再將2 g包合物懸浮于20 mL正己烷中，密封，在90 W、30 ℃條件下超聲波處理提取30 min，再將超聲波處理后的懸浮液在3 000 r/min下離心1 min，收集正己烷提取液。將甜橙油的正己烷溶液和包合物的正己烷提取液經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后進行GC-MS分析。

色譜試驗條件：色譜柱，HP-5毛細管柱30 m×0.25 mm×0.25 μm；載氣，高純氦氣99.999%，流速0.8 mL/min；進樣量1 μL，分流比1∶10；進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度300 ℃，TIC；升溫程序，起始溫度69 ℃保溫1 min,以1 ℃/min升溫至80 ℃，80 ℃保溫2 min，再以10 ℃/min升溫至200 ℃，200 ℃保溫1 min，280 ℃保溫1 min。

MS條件：電子轟擊離子源，電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃，EM電壓2 165 V，接口溫度250 ℃，溶劑延遲3 min，質(zhì)量范圍40～550 u。

1.2.2.3 粒徑分析

采用Mastersizer 2000激光粒度分析儀測定包合物的粒徑大小。以水作為分散介質(zhì)，將包合物的水溶液逐漸加入分散介質(zhì)中至激光強度為6%～10%。吸收率為0.001，乳清蛋白和水的折射率分別取1.350和1.330[19]。包合物的粒徑大小采用粒度分布曲線體積加權(quán)平均直徑D[4,3]和表面積加權(quán)平均直徑D[3,2]表示。每個樣品測定3次，測定結(jié)果取3次測定值的平均值。

1.2.2.4 含水率和水分活度分析

按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.3—2010[20]測定包合物中的水分含量。稱取10 g(精確到0.001 g)包合物于105 ℃的烘箱中干燥，每隔1 h稱量1次，干燥至恒重(前后2次質(zhì)量差不超過0.04 g)，準(zhǔn)確記錄干燥后包合物的質(zhì)量，并測定干燥后包合物中的甜橙油含量，每個樣品測定3次。按照公式(4)[21]計算包合物的含水率：

(4)

式中：φ,包合物的含水率，%；m3和m4,干燥前和干燥后包合物的質(zhì)量,g；m5和m6,干燥前和干燥后包合物中甜橙油的質(zhì)量,g。

包合物的水分活度采用H-3A型水分活度儀進行測定，測定溫度18 ℃，測定時間 10 min，每個樣品測定3次。

1.2.2.5 吸濕能力的測定

在25 ℃條件下，將Na2CO3、NaCl和K2SO4飽和溶液分別置于干燥器中模擬相對濕度為43%、75%、97%的環(huán)境[22]。將一定質(zhì)量的包合物置于干燥器中，每隔一段時間測定1次包合物的質(zhì)量，并根據(jù)公式(5)計算包合物的吸濕率：

(5)

式中：Ra,包合物的吸濕率，%；W0和Wn分別是包合物放入干燥器前后的質(zhì)量，g。

1.2.2.6 貯藏特性分析

將制得的包合物密封包裝后在25 ℃溫度下貯藏，分別貯藏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周后測定結(jié)合物中甜橙油的含量，計算包合物中的甜橙油保留率。包合物中甜橙油保留率的計算公式：

(6)

式中：λ,包合物中甜橙油保留率,%；m7,包合物中甜橙油含量,mg/g；m8,貯藏一段時間后包合物中甜橙油的含量,mg/g。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均設(shè)3次重復(fù)，將得到的試驗結(jié)果利用Microsoft Excel和正交設(shè)計助手Ⅱ?qū)I(yè)版進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 包合物制備條件的優(yōu)化

正交試驗結(jié)果、結(jié)果的方差分析及效應(yīng)曲線圖分別如表2、表3和圖1所示。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The result of orthogonal experiments

由表2中各因素的極差大小可知，各因素對甜橙油包合率的影響大小順序為C(乳清蛋白的質(zhì)量與甜橙油的體積比)>B(均質(zhì)壓力)>A(均質(zhì)次數(shù))。由表3可知，均質(zhì)壓力和乳清蛋白的質(zhì)量與甜橙油的體積比對甜橙油包合率的影響均較顯著(P<0.05)，結(jié)合圖1可知，這2個因素應(yīng)分別選擇40 MPa和1∶0.75作為最佳水平，而均質(zhì)次數(shù)對包合率影響不顯著，為減少生產(chǎn)中的工作量和儀器的損耗，均質(zhì)次數(shù)選擇3次最佳。

表3 正交試驗結(jié)果的方差分析Table 3 The analysis of variance of the result oforthogonal experiments

注：F0.05(2,2)=19.00

圖1 正交試驗效應(yīng)曲線圖Fig.1 Effect chart of orthogonal experiments

在最佳制備條件下制備包合物，結(jié)果表明，此條件下制備的包合物中甜橙油包合率為84.11%，RSD為3.06%，包合物中甜橙油的有效含量為346.36 mg/g。

2.2 包合物的性質(zhì)分析

2.2.1 紫外-可見光光譜分析

由圖2可以看出，甜橙油的石油醚溶液和無水乙醇溶液分別在307 nm處和317 nm處有特征吸收峰，

而乳清蛋白的石油醚溶液和無水乙醇溶液在307 nm和317 nm處均無吸收峰，表明乳清蛋白不會影響甜橙油含量的測定。物理混合物經(jīng)石油醚洗脫后，其無水乙醇提取液在317nm處沒有出現(xiàn)特征吸收峰，表明物理混合物中的甜橙油完全被石油醚洗脫，而包合物的無水乙醇提取液在317 nm處出現(xiàn)明顯的特征吸收峰，表明包合物能很好的保護甜橙油。

1-乳清蛋白的石油醚溶液；2-乳清蛋白的無水乙醇溶液；3-甜橙油的石油醚溶液；4-甜橙油的無水乙醇溶液；5-包合物無水乙醇提取液；6-物理混合物無水乙醇提取液圖2 甜橙油,乳清蛋白,甜橙油/乳清蛋白物理和包合物的紫外-可見光吸收光譜Fig.2 UV-visible absorption spectra of sweet orange oil,whey protein, sweet orange oil/whey protein physical mixture and inclusion complex

2.2.2 包合物中甜橙油組成成分分析

甜橙油在被包合前后組成成分如表4所示。

表4 甜橙油包合前后組成成分表Table 4 Profile of original and microencapsulated sweet orange oil

續(xù)表4

No組成成分甜橙油原油各組分相對百分比/%包合后的甜橙油各組分百分比/%20Carveol0.050.06213,7-dimethyl-2,6-Octadienal0.06ND22D-Carvone0.160.1823Octane, 1,1-diethoxy-0.050.08242,6-Octadien-1-ol, 3,7-dimethyl-, acetate, (Z)-0.210.3725Copaene0.100.1326Geranyl acetate0.090.24271H-Cyclopenta[1,3]cyclopropa[1,2]benzene,octahydro-7-methyl-3-methylene-4-(1-methylethyl)-0.070.0828Cyclohexane, 1-ethenyl-1-methyl-2,4-bis(1-methylethenyl)-0.090.1229Caryophyllene0.230.29301,6-Cyclodecadiene,1-methyl-5-methylene-8-(1-methylethyl)-0.090.1231Bicyclo[3.1.1]hept-2-ene,2,6-dimethyl-6-(4-methyl-3-pentenyl)-0.290.4132Humulene0.030.0733cis-β-Farnesene0.040.0734Naphthalene0.330.4435α-Bisabolene0.370.5736Phenol, 2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-0.080.0637Hexadecanoic acid, methyl ester0.050.06

從表4可以看出，包合前后，甜橙油的組成成分種類變化不大，甜橙油原油中含有37種成分，包合物中的甜橙油含有36種成分。其中甜橙油中的蒎烯、月桂烯、檸檬烯、芳樟醇、癸醛和巴倫西亞橘烯等[18]特征風(fēng)味成分在原油中的相對百分比分別為5.58%、1.96%、83.15%、0.35%、0.20%、0.33%，在被包合后這些特征風(fēng)味物質(zhì)的相對百分比分別為5.18%、1.84%、81.42%、0.39%、0.04%、0.44%，只有癸醛相差較大，這可能是因為在原油中癸醛的含量較少，檢測時誤差較大引起的。結(jié)果表明，在包合前后甜橙油的各組成成分保留效果較好，各組成成分的相對百分比沒有發(fā)生明顯的變化，可保持甜橙油特征風(fēng)味。

2.2.3 包合物的粒徑

在飲料加工工業(yè)中，為了提升飲料的穩(wěn)定性和品質(zhì)，原料的粒徑及其溶解性至關(guān)重要，小粒徑的原料更受青睞，因此包合物的粒徑是包合物的一個重要性質(zhì)參數(shù)[23]。乳清蛋白-甜橙油包合物在水溶液中粒徑分布如圖3所示。

圖3 包合物在水溶液中的粒徑分布曲線Fig.3 Curve of particle size of the inclusion complex in the water

由圖3可知，包合物顆粒大小分布均勻，粒徑主要分布在100～600 nm，包合物的表面平均直徑D[3,2]為(180±8)nm，體積平均直徑D[4,3]為(333±5) nm。只有少量包合物的粒徑較大，粒徑在600～2 000 nm，這些粒徑較大的包合物可能是因為溶解過程中部分包合物聚集形成，但仍小于大多數(shù)原料的粒徑，所以該包合物的粒徑大小適合應(yīng)用于飲料加工。

2.2.4 含水率及水分活度

包合物的含水率和水分活度分別為(4.59±0.46)%和0.211±0.037。一些研究表明，當(dāng)食品的水分活度低于0.3時微生物不再繁殖[24]，且當(dāng)包合物的含水率在低于5%時有利于產(chǎn)品的貯藏穩(wěn)定性[25]。因此，該包合物的含水率和水分活度有利于包合物的貯藏。

2.2.5 吸濕能力分析

在相對濕度為43%、75%和97%的環(huán)境下乳清蛋白-甜橙油包合物的吸水率隨時間變化如圖4所示。當(dāng)相對濕度為97%時，包合物在起始階段可快速吸水，放置8 h時吸水率即可達到8.73%，此時包合物已經(jīng)由粉末狀凝結(jié)成塊狀，表明包合物具有較強的吸濕性。當(dāng)相對濕度為75%時，包合物在放置16 h后吸水率達到8.41%，但當(dāng)相對濕度為43%時包合物在放置32 h后吸水率僅1.48%，包合物仍呈干燥的粉末狀。結(jié)果表明包合物具有較強的吸濕性能，應(yīng)置于相對濕度在43%以下的環(huán)境下保存。

圖4 不同相對濕度環(huán)境下包合物的質(zhì)量變化Fig.4 The weight of inclusion complex at different relative humidity condition

2.2.6 貯藏特性分析

貯藏過程中包合物中甜橙油的保留率如圖5所示。在貯藏的起始階段，隨著貯藏時間的延長，包合物中的甜橙油的保留率逐漸減少，這可能是因為包合物表面的甜橙油在貯藏過程中揮發(fā)引起的。當(dāng)貯藏時間達到9周后，甜橙油的保留率趨于穩(wěn)定，保存10周時甜橙油的保留率為93.74%，說明包合物對甜橙油具有較好的保護作用，可長期貯藏。

圖5 貯藏過程中包合物中甜橙油的保留率Fig.5 The retention rate of sweet orange oil in the inclusion complex during the storage

3 結(jié)論

(1)通過正交試驗優(yōu)化出乳清蛋白包合甜橙油的最佳條件為均質(zhì)次數(shù)3次、均質(zhì)壓力40 MPa、乳清蛋白的質(zhì)量與甜橙油的體積比1∶0.75(g∶mL)，在此條件下甜橙油的包合率可達84.11%，RSD為3.06%，包合物中甜橙油的有效含量為346.36 mg/g。

(2)紫外-可見光光譜分析表明乳清蛋白-甜橙油包合物已形成。經(jīng)GC-MS分析可知，被包合后的甜橙油中蒎烯、月桂烯、檸檬烯、芳樟醇、癸醛和巴倫西亞橘烯等特征風(fēng)味成分保留較好，且各組分的相對百分比與甜橙油原油相似，包埋過程對甜橙油的風(fēng)味影響較小，可保留甜橙油的天然風(fēng)味。

(3)包合物的粒徑分布均勻，主要在100～600 nm之間，表面積平均直徑為D[3,2]為(180±8) nm，體積平均直徑D[4,3]為(333±5) nm，適用于飲料加工。包合物的含水率和水分活度分別為(4.59±0.46)%和0.211±0.037，適于貯藏，但包合物易吸濕，所以應(yīng)放置于相對濕度在43%以下的環(huán)境下保存。

(4)在25 ℃溫度下，包合物密封貯藏10周時甜橙油的保留率為93.74%，包合物對甜橙油的保護效果較好，可長期貯藏。