劉阿梅，林 姿，徐 曼，趙子慧，楊?yuàn)檴?，陳培?/p>

(溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江溫州 325035)

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的飛速發(fā)展，農(nóng)藥的使用越來(lái)越廣泛，它們對(duì)植物、動(dòng)物和人類的危害越來(lái)越嚴(yán)重。一方面，它們可以直接進(jìn)入生物體內(nèi)，引起急性、慢性中毒和畸變，另一方面，通過(guò)徑流、排污、揮發(fā)等途徑進(jìn)入土壤、大氣和水體，引起各種生態(tài)環(huán)境下生物的死亡，并通過(guò)食物鏈的富集傳遞，影響人類食品安全[1-2]。

草甘膦(GPS)為廣譜性有機(jī)磷除草劑，是世界上應(yīng)用最廣、用量最大的農(nóng)藥品種[3-5]，隨著對(duì)“抗草甘膦”作物的不斷研究與種植，草甘膦的使用量必然不斷增加。據(jù)預(yù)測(cè)，未來(lái)幾年草甘膦的需求量將保持15%的增速，草甘膦對(duì)人類健康和生態(tài)毒性的潛在威脅日益凸顯。有研究發(fā)現(xiàn)草甘膦對(duì)水生環(huán)境有潛在的威脅[6]。Relyea[7]指出使用草甘膦會(huì)造成蝌蚪大量死亡。草甘膦制劑(roundup)對(duì)金魚的急性毒性(carassius auratus)的相關(guān)研究表明，草甘膦制劑與金魚細(xì)胞的微核率、細(xì)胞核核異常及鏈斷裂損傷等存在明顯的濃度劑量效應(yīng)關(guān)系[7-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，人在工作中接觸農(nóng)藥，包括接觸草甘膦為活性劑的農(nóng)達(dá)，即便通過(guò)孕婦配偶的男性接觸，也可能導(dǎo)致生育問(wèn)題[10]。除此之外，孕前接觸草甘膦除草劑提高而后流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，孕后接觸草甘膦除草劑通常與晚期自然流產(chǎn)相關(guān)。另外，注射服用草甘膦后，觀察到血液、肝臟與睪丸中氧化應(yīng)激狀態(tài)衰變，可能與繁殖性毒性關(guān)聯(lián)[11]。而關(guān)于草甘膦是否會(huì)影響胚胎發(fā)育及其機(jī)制、早期胚胎對(duì)草甘膦的敏感濃度，卻未見(jiàn)有詳細(xì)報(bào)道，草甘膦的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)尚待揭示[12]。因此，我們利用熱帶爪蟾作為模式生物，研究草甘膦對(duì)早期胚胎發(fā)育的影響機(jī)制，熱帶蟲蟾因其個(gè)體小、生長(zhǎng)周期短，胚胎發(fā)育模式與人類相近，而且其基因組簡(jiǎn)單更適合作為模式生物用于人類基因的研究[13-14]。用不同濃度梯度的草甘膦處理熱帶爪蟾囊胚期的胚胎，通過(guò)檢測(cè)胚胎死亡率、畸形率評(píng)價(jià)草甘膦對(duì)早期胚胎的發(fā)育毒性效應(yīng)。同時(shí)，這些研究也將為環(huán)境評(píng)估中草甘膦安全濃度的設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1主要試劑。草甘膦(damas-beta)、人絨毛膜促性腺激素(HCG，寧波第二激素廠)、L-半胱氨酸以及二甲基亞砜(生工生物工程有限公司)、Nikon SMZ 1000 體視顯微鏡。0.1×MMR(0.1 mol/L NaCl、2.0 mmol/L KCl、1 mmol/L MgSO4、2 mmol/L CaCl2、5 mmol/L HEPES、0.1 mmol/L EDTA)。

1.1.2試驗(yàn)材料。 選自本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的性成熟的熱帶爪蟾及其胚胎。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1胚胎的獲取。選取本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的雌雄熱帶爪蟾多對(duì)，采用人工注射HCG的方法進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)卵，用2%半胱氨酸溶液去除卵外膠質(zhì)膜，待發(fā)育到囊胚末期、原腸胚前期(stage9～10)，對(duì)正常的胚胎進(jìn)行染毒試驗(yàn)[15]。

1.2.2胚胎的暴露試驗(yàn)(FETAX)。根據(jù)查閱資料及前期預(yù)試驗(yàn)，將草甘膦用二甲基亞砜(DMSO)溶解后稀釋成0、10-5、10-4、10-3mol/L 4個(gè)濃度，用0.1×MMR稀釋成相應(yīng)的濃度梯度，為了減少試驗(yàn)誤差以及避免受精過(guò)程的不確定性，在囊胚期于顯微鏡下挑選發(fā)育正常的熱帶爪蟾胚胎，并從囊胚期開始染毒至原腸期結(jié)束(約3 h)。用直徑10 cm的培養(yǎng)皿作為染毒試驗(yàn)容器，加入50 mL草甘磷溶液， 150只stage 9～10發(fā)育良好的胚胎，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行組，于恒溫培養(yǎng)箱(26±0.5)℃黑暗培養(yǎng)12 h，之后每24 h換一次液[14-15]。

1.2.3顯微觀察。每間隔6 h 記錄各濃度組胚胎死亡、畸形的情況，用體視顯微鏡觀察胚胎，并拍照和記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4數(shù)據(jù)處理。運(yùn)用Spass13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，采用 t 檢驗(yàn)進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P< 0.05 (*),P< 0.01(**)。

2 結(jié)果與分析

2.1草甘膦處理熱帶爪蟾胚胎后形態(tài)觀察囊胚期與原腸胚時(shí)期是胚胎發(fā)育過(guò)程最關(guān)鍵的時(shí)期，在這2個(gè)時(shí)期，胚胎經(jīng)歷了三胚層的分化、細(xì)胞命運(yùn)決定、細(xì)胞遷移等重要的生命過(guò)程，它是組織和器官原基形成的關(guān)鍵時(shí)期。假如，在這2個(gè)時(shí)期發(fā)育異常，將直接導(dǎo)致后期發(fā)育的正常進(jìn)程。因此，挑選囊胚期(stage7～8)發(fā)育正常的胚胎，并進(jìn)行不同梯度的草甘膦染毒試驗(yàn)，到stage12(原腸胚末期)撤去草甘膦，并換上新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)96 h。

當(dāng)囊胚期與原腸胚期的胚胎進(jìn)行草甘膦染毒處理后，爪蟾胚胎后期的發(fā)育受到不同程度的影響。胚胎在草甘膦處理后的毒性效應(yīng)下，表現(xiàn)出不同程度的畸形現(xiàn)象(圖1)。其中圖1(1～4)為原腸胚期的胚胎(stage12)，在草甘膦的作用下，此時(shí)期的胚胎表現(xiàn)出不同程度的發(fā)育遲緩(3～4)，尤其表現(xiàn)在胚孔背唇不能閉合。圖1(5～8)為神經(jīng)胚期胚胎(stage17)，由于前期原腸期草甘膦染毒的影響，出現(xiàn)胚孔無(wú)法閉合(圖1)，導(dǎo)致神經(jīng)胚時(shí)胚胎不能正常形成神經(jīng)板(6～8)。隨著發(fā)育進(jìn)程的繼續(xù)，爪蟾胚胎的畸形率和死亡率繼續(xù)在增加。在胚胎發(fā)育至尾牙期中期(stage31),圖1(9～12)表現(xiàn)出不同程度的腹方化與體節(jié)變短、斷尾、眼睛發(fā)育異常以及脊柱彎曲等畸形表型。隨著草甘膦毒性效應(yīng)的積累，在胚胎發(fā)育至尾牙晚期stage38，主要出現(xiàn)頭部異常、脊柱彎曲和軀體色素減少等發(fā)育異常的癥狀[圖1(13～16)]。當(dāng)胚胎發(fā)育至蝌蚪期時(shí)stage40～46[圖1(17～28)]，草甘膦的毒性效應(yīng)更為明顯，出現(xiàn)大量圍心腔水腫(18～19)，尾巴彎曲(19，22,26)，短尾和無(wú)尾，以及三角錐形大頭等嚴(yán)重的畸形特征的表型現(xiàn)象(22,23,24,27,28)，眼睛變小(18)，以及心臟發(fā)育異常(27,28)。

同時(shí)，我們對(duì)胚胎染毒后的24、48、72、96 h等4個(gè)階段胚胎的不同程度畸形進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(圖2)，熱帶爪蟾的囊胚后期以及原腸胚期胚胎在受到草甘膦處理后，胚胎的正常發(fā)育的軌跡被擾亂，導(dǎo)致胚胎不同程度畸形，甚至死亡。主要表現(xiàn)發(fā)育遲緩、色素減少、脊柱和尾部彎曲、短尾和無(wú)尾、眼睛變小以及圍心腔水腫等。表明，草甘膦對(duì)熱帶爪蟾胚胎產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性效應(yīng)，嚴(yán)重影響胚胎發(fā)育正常進(jìn)行。

注：St12：stage12原腸胚期胚胎(1～4)：1，對(duì)照組正常胚胎；3～4.實(shí)驗(yàn)組草甘膦處理后畸形胚胎；st17. stage17神經(jīng)胚期胚胎(5～8);5.對(duì)照組正常胚胎, 6～8.實(shí)驗(yàn)組草甘膦處理后畸形胚胎；st31.stage31尾牙期中期胚胎，9.對(duì)照組正常胚胎，10～12.實(shí)驗(yàn)組草甘膦處理后畸形胚胎；st38.stage38尾牙晚期胚胎(13～16);13.對(duì)照組正常胚胎;14～16.實(shí)驗(yàn)組草甘膦處理后畸形胚胎； st40.stage40蝌蚪期早期(17～20);17.對(duì)照組正常胚胎;18～20.實(shí)驗(yàn)組草甘膦處理后的畸形胚胎;st42.stage42蝌蚪期中期(21～24);21.對(duì)照組正常胚胎;22～24.實(shí)驗(yàn)組草甘膦處理后的畸形胚胎后期胚胎；st46.stage46蝌蚪期后期(25～28);25.對(duì)照組正常胚胎;26～28.實(shí)驗(yàn)組草甘膦處理后的畸形胚胎Note:St12.stage12 embryo at gastrula stage(1-4); 1.Normal fetus of control; 3-4. Deformed embryo treated with glyphosate of experimental group ; st17.Stage17 embryo at the neurula stage(5-8);5.Normal fetus of control;6-8. Deformed embryo treated with glyphosate of experimental group ;st31.stage31 embryo of middle tail period 9. Normal fetus of control;10-12. Deformed embryo treated with glyphosate of experimental group .st38.stage38 embryo of late tail period (13-16);13.normal fetus of control;14-16.Deformed embryo treated with glyphosate of experimental group ;st40.stage40 early tadpole period(17-20) ;17.Normal fetus of control;18-20.Deformed embryo treated with glyphosate of experimental group ;st42.stage42 middle tadpole period (21-24) ;21.Normal fetus of control;22-24.Deformed embryo treated with glyphosate of experimental group ;st46.stage46 late tadpole period(25-28);25.Normal fetus of control;26-28.Deformed embryo treated with glyphosate of experimental group圖1 草甘膦對(duì)熱帶爪蟾胚胎發(fā)育的致畸效應(yīng)Fig.1 Teratogenic effects of glyphosate on embryonic development of Xenopus tropicalis

注：A、B、C、D分別為胚胎染毒結(jié)束后的stage31，stage38，stage40，stage46等四個(gè)時(shí)期胚胎不同畸形程度百分比統(tǒng)計(jì)(n>100)Note:A,B,C,and D are the percentages of different degrees of abnormality of embryos in stage 31,stage38,stage40,and stage46 after embryo exposure (n>100)圖2 不同濃度草甘膦對(duì)不同時(shí)期胚胎的畸形程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)Fig.2 Statistics on the degree of malformation of embryos at different stages by different concentrations of glyphosate

2.2不同濃度的草甘膦對(duì)熱帶爪蟾胚胎發(fā)育畸形率和死亡率的影響為探究草甘膦對(duì)胚胎毒性效應(yīng)的劑量關(guān)系，草甘膦對(duì)熱帶爪蟾胚胎發(fā)育的總畸形率和死亡率的影響統(tǒng)計(jì)如圖3所示。由圖3可知，胚胎在10-3mol/L草甘膦藥物處理組的畸形率與對(duì)照組呈顯著差異(P<0.01，其他處理濃度組中的畸形率沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。在胚胎死亡率的統(tǒng)計(jì)上，與對(duì)照組比較，草甘膦處理組死亡率明顯上升(P<0.05)，尤其在10-3mol/L組中死亡率顯著增加(P<0.01)，神經(jīng)胚期觀察的10-3mol/L草甘膦藥物處理組死亡率呈顯著差異(P<0.05)，在所有組別中，畸形率都明顯大于死亡率，尤其在10-3mol/L的草甘膦處理組中畸形率明顯大于死亡率(P<0.01)。

注: WT.對(duì)照組， 無(wú)顯著性差異(P>0.05);*. P <0.05;**P<0.01Note:WT.Control,no significant difference (P>0.05);* P<0. 05;** P<0.01圖3 不同濃度草甘膦對(duì)熱帶爪蟾胚胎畸形率和死亡率的影響Fig.3 Effect of different concentrations of glyphosate on embryonic malformation rate and mortality of Xenopus tropicalis

2.3草甘膦對(duì)不同時(shí)期熱帶爪蟾胚胎發(fā)育畸形率和死亡率的影響胚胎發(fā)育是一個(gè)個(gè)體不斷完善的動(dòng)態(tài)過(guò)程，隨著發(fā)育的進(jìn)行，各部分組織和器官原基不斷形成。由圖4可知，不同時(shí)期胚胎的對(duì)照組與10-3mol/L草甘膦處理組比較畸形率明顯上升(P<0.05和P<0.01),同時(shí)在此處理組下，不同時(shí)期胚胎的畸形率隨著發(fā)育的進(jìn)行不斷減小。處理組中不同時(shí)期胚胎的死亡率也是早期比晚期高。因此，統(tǒng)計(jì)草甘膦處理胚胎后不同時(shí)期的胚胎對(duì)于體內(nèi)積累的毒素壓力承受能力，分析不同時(shí)期胚胎的畸形率和死亡率的變化情況，評(píng)定胚胎抵御外界壓力的能力。

注:WT.對(duì)照組， 無(wú)顯著性差異(P>0.05);* P<0.05;** P<0.01Note:WT.Control,no significant difference (P>0.05);* P<0.05;** P<0.01圖4 草甘膦對(duì)不同時(shí)期胚胎的畸形率和死亡率的影響Fig.4 Effect of glyphosate on malformation and mortality of embryos at different stages

3 討論

3.1草甘膦對(duì)熱帶爪蟾胚胎發(fā)育的影響爪蟾胚胎致畸YAA 試驗(yàn)(FETAX)是檢測(cè)污染物發(fā)育毒性的常用檢測(cè)方法[11]，通過(guò)存活率、畸形率和抑制生長(zhǎng)率等指標(biāo)來(lái)表征化合物的毒性強(qiáng)弱[12-13]，并在一定程度上反映受測(cè)污染物對(duì)機(jī)體的致畸機(jī)制[14，16]。試驗(yàn)表明，當(dāng)草甘膦濃度達(dá)到10-3mol/L時(shí)，它對(duì)熱帶爪蟾胚胎有極顯著的毒性效應(yīng)影響(P<0.01)。伴隨著較高的死亡率，草甘膦對(duì)胚胎還有大量的致畸作用，有小眼、圍心腔水腫、尾部彎曲等畸形表型，其中表現(xiàn)出的腹方化是一種特異性的畸形表型。

這些結(jié)果可能是由于我們用草甘膦染毒對(duì)胚胎整個(gè)原腸期進(jìn)行處理，使得草甘膦的毒性聚集干擾了胚胎原腸運(yùn)動(dòng)的進(jìn)行。而原腸運(yùn)動(dòng)又是生命開始至關(guān)重要的一個(gè)環(huán)節(jié)[16]，在此期間伴隨著原腸細(xì)胞的時(shí)空定位指導(dǎo)組織和器官原基的形成，推動(dòng)生命發(fā)生的有序進(jìn)程。如果此過(guò)程被阻斷，胚胎發(fā)育將產(chǎn)生缺陷如滯育、畸形甚至死亡。草甘膦處理熱帶爪蟾原腸期后，胚胎發(fā)育早期原腸末期導(dǎo)致胚孔不能閉合，神經(jīng)胚期部分神經(jīng)板不能正常形成，胚芽期后出現(xiàn)較為明顯的小眼、圍心腔水腫、尾部以及脊柱彎曲等畸形特征以及死亡現(xiàn)象。這些現(xiàn)象都可能是草甘膦積累毒性影響原腸運(yùn)動(dòng)中一些細(xì)胞命運(yùn)決定基因的表達(dá)，從而影響胚胎發(fā)育。故而，接下來(lái)對(duì)于草甘膦致畸機(jī)制的研究，可從這一控制胚胎發(fā)育畸形表型基因著手。

除此之外，針對(duì)10-5mol/L草甘膦處理的胚胎的畸形率與死亡率小于對(duì)照組的胚胎這種現(xiàn)象，說(shuō)明10-5mol/L和10-3mol/L 2種濃度的草甘膦的致畸機(jī)制不同，在10-5mol/L的濃度下，胚胎會(huì)受到某些因素的調(diào)控，使畸形率與死亡率比對(duì)照組低?？赡艿脑蚴桥咛サ钟饨绲哪芰υ诘蜐舛榷疚锉┞蹲饔孟律叩囊环N刺激反應(yīng)，稱此反應(yīng)為“毒物興奮效應(yīng)”[17-18]。

3.2草甘膦對(duì)于生態(tài)環(huán)境存在潛在危機(jī)除草劑是最有效和經(jīng)濟(jì)的雜草防治方法，中國(guó)作為一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用除草劑，使主要農(nóng)藝作物田中的雜草防治問(wèn)題基本解決[19-20]。隨著農(nóng)業(yè)科學(xué)不斷的發(fā)展，抗草甘膦作物研制成功，使草甘膦被廣泛迅速應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、園藝等作物雜草防治中。隨著大量的使用，生物富集不斷累加；通過(guò)食物鏈的各級(jí)消費(fèi)者途徑，無(wú)論是水生生物還是脊椎動(dòng)物乃至人類體內(nèi)都會(huì)不斷殘留。大量研究結(jié)果證明，草甘膦對(duì)生物會(huì)產(chǎn)生明顯的毒性；草甘膦使用不當(dāng)，很可能造成潛在生態(tài)危機(jī)。熱帶爪蟾的基因組與人類基因組有很多的共性，草甘膦對(duì)熱帶爪蟾胚胎發(fā)育產(chǎn)生明顯的毒性作用，這可能警示它可能影響人類的生存發(fā)育狀況。

4 結(jié)論

(1)草甘膦對(duì)熱帶爪蟾胚胎發(fā)育有顯著的致毒作用；對(duì)胚胎死亡率、畸形率、體長(zhǎng)造成影響，引起多種毒性效應(yīng)。

(2)草甘膦對(duì)熱帶爪蟾的發(fā)育毒性可能是其干擾胚胎原腸運(yùn)動(dòng)過(guò)程中細(xì)胞命運(yùn)決定基因的表達(dá)，致使胚胎發(fā)育不能正常進(jìn)行。其次也可能是草甘膦影響胚胎內(nèi)抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致胚胎抵御環(huán)境壓力能力減弱。

(3)熱帶爪蟾的基因組與人類基因組有相當(dāng)多的共性，更適合利用熱帶爪蟾做人類基因研究。因此，該試驗(yàn)結(jié)果可以在一定條件下推廣至草甘膦對(duì)人類乃至其他脊椎動(dòng)物的影響。